人干细胞因子cDNA克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以超速离心法提取的HepG2细胞总RNA为模板，应用RT-PCR技术扩增得到编码人干细胞因子（SCF）全长CDNA（约0.8kb）。克隆、序列分析确证编码人SCF膜外活性区的CDNA（约0.5kb）结构正确，构建了含有该基因的表达质粒（PBV-mhSCF）并在大肠杆菌中获得高效表达。

人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性

人干细胞生长因子(humanstemcellgrowthfactor,hSCGF)是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式,包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域(calcium-dependentcarbohydraterecognitiondomain,CRD)内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ。hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性。本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。为克服hSCGF的cDNAGC含量较高的困难,本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库(Clontech)中成功克隆hSCGFcDNA,进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中,融合表达。研究结果表明,通过低温诱导(28℃),重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中,利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性分析表明,不同于截短型分子hSCGFβ,全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖。结论:hSCGFCRD不直接结合受体,可能具有其他生物学功能。

人干细胞因子(SCF)5’旁侧调控序列与其全长cDNA融合克隆的构建及鉴定

目的 :为研究人干细胞因子 (SCF) 5’旁侧 1.42 kb区域内不同序列对全长 c DNA在真核细胞中表达的调控作用 ,构建了 SCF5’旁侧 1.42 kb的调控序列与其 1.2 kb的全长 c DNA融合克隆。方法 :将 PCR获得的 SCF5’旁侧 1.42kb的调控序列与 RT- PCR获得的其 1.2 kb的全长 c DNA克隆入 p GEM- T载体 ,筛选正确插入方向 ,利用合适的限制性内切酶从中切出三个片段依次亚克隆入 p UC19克隆载体中。结果 :获得了 SCF5’旁侧 1.42 kb的调控序列与其 1.2 kb的全长 c DNA并成功地构建了它们的融合克隆。结论 :T-载体在克隆添加了少量具有 3’→ 5’外切核酸酶的 PCR产物中仍然有效 ;在稍大片段的基因克隆操作中 ,利用分段亚克隆的方法 ,避开干扰另外的酶切位点 ,依次分段亚克隆更为可行。