人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。

苏州地区儿童hMPV流行病学特征及胸腺基质淋巴细胞生成素在hMPV感染喘息患儿中的作用

目的:了解近年来江苏苏州地区儿童偏肺病毒(h MPV)流行病学特征,并探讨胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)在h MPV感染喘息儿童中的作用。方法:回顾性分析2009年1月至2014年12月苏州大学附属儿童医院呼吸科住院治疗的372例h MPV下呼吸道感染患儿。采用ELISA法检测35例单纯h MPV感染并伴有喘息的肺炎患儿、15例单纯h MPV感染无喘息的肺炎患儿以及34例其他病原感染并伴有喘息的肺炎患儿血浆中TSLP、IL-4和IL-2水平。结果:下呼吸道感染患儿h MPV总检出率为2.75%,2010年检出率最高,春季检出率最高,秋季检出率最低,每年的2月至5月为h MPV检出高峰%,5岁以内检出率较高。单纯h MPV感染且伴有喘息的肺炎患儿血浆中TSLP及IL-4水平明显高于h MPV感染非喘息患儿以及非h MPV感染喘息患儿(P均<0.05)。结论:苏州地区各年度h MPV检出率有所波动,5岁以内儿童检出率较高,春季检出率最高。h MPV感染后可引起TSLP表达增强,可能与Th2细胞免疫亢进及喘息有关。

二甲亚砜诱导人支气管上皮细胞炎症因子胸腺基质淋巴细胞生成素的表达

目的探讨二甲亚砜(DMSO)对人支气管上皮细胞炎症关键分子——胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)表达的影响。方法用不同浓度DMSO(0.1%、1%、2.5%)孵育人支气管上皮细胞,分为对照组和各浓度组,收集细胞及上清液后,采用实时定量PCR检测细胞TSLPmRNA表达水平,ELISA技术检测细胞培养上清中TSLP浓度。结果 DMSO显著诱导人支气管上皮细胞TSLPmRNA表达(P<0.01),并呈浓度依赖性。分泌型TSLP水平也随之增高(P<0.01)。高浓度DMSO对细胞生长有抑制作用。结论 DMSO可能影响了支气管上皮细胞的免疫调节功能。

色胺酮抑制胸腺基质淋巴细胞生成素促肥大细胞增殖的药理机制

目的探讨色胺酮抑制由胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)促肥大细胞增殖的药理机制,为色胺酮治疗肥大细胞相关过敏性皮炎提供理论依据。方法在TSLP刺激人源肥大细胞系-1(HMC-1)细胞增殖的前提下,同步采用色胺酮处理增殖的细胞,观察对细胞增殖的影响和相关蛋白水平变化。噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度色胺酮处理对细胞活力的影响;溴脱氧尿苷渗入试验和Ki67 mRNA水平检测不同处理组细胞增殖情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测鼠双微体基因2(MDM2)、P53、Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)剪切蛋白水平变化;实时荧光定量聚合酶链反应检测白细胞介素7受体α(IL-7Ra)和TSLPR mRNA的含量。结果 MTT比色法结果表明,色胺酮无细胞毒性;溴脱氧尿苷渗入试验和Ki67 mRNA水平的检测均显示色胺酮抑制TSLP刺激的肥大细胞增殖;色胺酮抑制TSLP刺激的HMC-1中MDM2蛋白表达水平,蛋白灰度分析比较差异有统计学意义;色胺酮处理后,HMC-1细胞中,P53蛋白和凋亡标志蛋白Caspase-3、PARP剪切蛋白水平升高,且蛋白灰度分析比较差异有统计学意义;TSLP上游调控蛋白IL-7Ra和TSLPR mRNA水平在色胺酮的作用下受到抑制。结论色胺酮可抑制TSLP促肥大细胞增殖,对治疗肥大细胞相关过敏性皮炎有一定的潜力。

活性维生素D3下调屋尘螨诱导的气道上皮细胞胸腺基质淋巴生成素蛋白释放

目的探讨屋尘螨（HDM）对气道上皮细胞系（16．HBE）胸腺基质淋巴生成素（TSLP）表达的影响，进一步评价活性维生素D，（1,25VD3）的干预作用。方法四唑盐（MTT）比色法检测不同浓度HDM（200、400、800U／L）及其联合10^-8mol/L1,25VD3对16．HBE活力的影响。按下述分组刺激16-HBE，对照组，400U/LHDM组，10^-8mol/L,25VD3组，10^-8mol/L1，25VD3预处理1h后400U/LHDM组，10^-8mol/L1,25VD3联合400U/LHDM组，6h后，实时荧光定量PCR检测细胞TSLPmRNA表达情况；刺激24h后，ELISA检测细胞培养上清中TSLP的浓度。结果200-800U/LHDM作用气道上皮细胞后，可以上调16-HBETSLP的基因和蛋白表达（P〈0．05）；10^-8mol/L1,25VD3预处理后400U/LHDM组的TSLP蛋白水平较400U/LHDM组显著下降（P〈0．05）；但10^-8mol/L1,25VD3联合400U／LHDM组的TSLP蛋白水平较400U/LHDM组无显著差异（P=0．58）。结论HDM和1,25VD3均可增加16-HBETSLP的表达和释放。1,25VD3预处理气道上皮细胞可减少屋尘螨诱导的TSLP分泌。

hTSLP在子痫前期孕妇胎盘中的表达及意义

目的:通过研究人胸腺基质淋巴细胞生成素(hTSLP)在正常及子痫前期孕妇胎盘中表达的差异,探讨hTSLP在母胎界面免疫耐受中可能发挥的调节功能,及其在子痫前期发病中的作用。方法:收集剖宫产分娩的正常、轻度及重度子痫前期产妇胎盘各10例,分别采用实时荧光定量PCR技术、蛋白质印迹法及免疫组化方法分析hTSLP在正常及子痫前期产妇胎盘组织中的表达情况。采用t检验及Fisher's精确检验进行统计学分析。结果:1重度子痫前期组胎盘组织中hTSLP mRNA及蛋白表达均低于对照组及轻度子痫前期组(P<0.05),轻度子痫前期组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。2hTSLP蛋白在直接接触母体血流的合体滋养细胞的胞浆中表达。结论:hTSLP作为一种免疫调节因子,可能参与母胎界面免疫调节,其缺乏时,可能与重度子痫前期的发病有关。

Ag85B慢病毒抑制人支气管上皮细胞TSLP及其受体的表达

目的:研究结核分枝杆菌抗原85B(Ag85B)慢病毒对正常人支气管上皮细胞(NHBEC)表达胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)和其受体TSLPR的影响,探究Ag85B抑制哮喘气道炎症的机制。方法:将Ag85B基因重组质粒转入293T细胞,构建携带Ag85B和EGFP报告基因的慢病毒载体p LVXIRES-Neo-EGFP-Ag85B(Ag85B慢病毒)。用鉴定后的Ag85B慢病毒感染HEK293细胞,计算滴度并观察感染效率。利用Lipofectamine? 2000使Ag85B慢病毒感染体外培养NHBEC,设立空病毒感染和空白对照组。Real-time PCR和Western blotting检测Ag85B、TSLP和TSLPR mRNA和蛋白表达水平。结果:成功构建Ag85B慢病毒感染NHBEC体系,Ag85B慢病毒感染NHBEC 48 h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,细胞生长状态良好,病毒滴度为2×1011TU/L,感染效率达到90%以上。Real-time PCR和Western blotting结果显示Ag85B慢病毒成功感染NHBEC,可见相应Ag85B mRNA和蛋白表达。与空病毒感染和空白对照组比较,Ag85B慢病毒感染组TSLP mRNA表达有下降趋势,TSLPR mRNA与TSLP和TSLPR的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论:Ag85B慢病毒感染NHBEC可以抑制NHBEC的TSLP和TSLPR的表达,提示Ag85B可能通过靶向阻滞TSLP-TSLPR途径抑制哮喘气道炎症。

薄荷醇通过激活瞬时受体电位M8(TRPM8)促进BEAS-2B人支气管上皮细胞的细胞因子分泌

目的探讨瞬时受体电位M8(TRPM8)在薄荷醇诱导BEAS-2B人支气管上皮细胞表达气道上皮源性细胞因子白细胞介素25(IL-25)、IL-33和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)中的作用及其相关信号转导机制。方法用2 mmol/L薄荷醇处理BEAS-2B细胞1、2、3、4 h,选择IL-25、IL-33、TSLP或Ca^(2+)表达较高的时间组,通过小干涉RNA(siRNA)特异性敲低TRPM8(si-TRPM8),采用细胞内钙离子螯合剂1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸四乙酰氧甲基酯(BAPTA-AM)及核因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)处理。CCK-8法检测细胞活力;实时荧光定量PCR检测IL-25、IL-33和TSLP mRNA表达;ELISA检测培养上清液IL-25、IL-33和TSLP蛋白水平;Fluo-4 AM负载结合流式细胞术检测胞内Ca^(2+)荧光强度;Western blot法检测si-TRPM8对BEAS-2B细胞合成TRPM8蛋白的干扰效率及NF-κB p65蛋白表达的影响。结果与空白对照组比,薄荷醇组IL-25、IL-33、TSLP mRNA及蛋白、胞内Ca^(2+)水平和NF-κB p65蛋白表达均增加;敲低TRPM8后,抑制薄荷醇诱导的Ca^(2+)、IL-25、IL-33、TSLP和NF-κB p65表达增加,BAPTA-AM和PDTC均可抑制薄荷醇诱导的IL-25、IL-33和TSLP的高表达。结论薄荷醇通过激活TRPM8引起Ca^(2+)浓度升高、激活NF-κB通路诱导BEAS-2B支气管上皮细胞IL-25、IL-33和TSLP的分泌。

TSLP在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜的表达及临床意义

目的探讨胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)在溃疡性结肠炎患者结肠黏膜上皮内的表达及其临床意义。方法分别采集溃疡性结肠炎患者结肠黏膜组织22例,健康人群结肠黏膜组织20例,将溃疡性结肠炎患者进行Mayo评分及分期,分别测出其血清C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)水平,通过免疫荧光法及免疫印迹法(Western blot,WB)检测溃疡性结肠炎患者结肠黏膜TSLP蛋白的表达,比较免疫印迹结果与CRP、ESR水平及Mayo评分的相关性。结果溃疡性结肠炎患者TSLP表达水平明显增加,主要表达于肠上皮腺体及基质内炎性细胞中;UC患者肠上皮黏膜内TSLP相对表达为1.076±0.091,健康对照组0.604±0.098,且与CRP、ESR水平呈正相关,与Mayo评分即疾病的活动度呈正相关。结论 TSLP的过表达提示其可能参与UC的发病机制。