人NEDD8原核表达及兔高免血清制备

本研究根据基因比对,将合成的nedd8基因(HN8)酶切克隆入p Cold-TF原核表达载体中,命名为p Cold-HN8,转化到感受态宿主菌BL21(DE3)中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于16℃中诱导表达24 h,超声波裂解,通过His-bind纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE检测,结果 HN8蛋白获得可溶性表达,融合蛋白大小为64 k Da。用纯化的蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,经Western Blot和间接免疫荧光试验证实,兔抗HN8蛋白的血清能够特异性识别HN8蛋白。这为进一步研究HN8蛋白在Neddylation通路中的修饰作用奠定了基础。

驴源马疱疹病毒8型ORF72基因原核表达及多克隆抗体制备

为了获得驴源马疱疹病毒8型ORF72基因编码的糖蛋白D(glycoprotein D,gD)和多克隆抗体,试验根据GenBank上公布的EHV-8 gD基因序列,设计了特异性引物,使用PCR方法扩增得到主要抗原区和跨膜区片段共960 bp,并构建pET-32a-gD960原核表达载体。将重组质粒pET-32a-gD960转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导并优化表达,获得gD重组蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定表达产物。使用包涵体蛋白纯化试剂盒纯化gD重组蛋白,并免疫小鼠,共免疫3次,每次间隔2周。三免2周后,通过Western-blot对鼠抗EHV-8 gD多克隆抗体进行鉴定,并使用间接ELISA测定其效价。结果表明:试验成功构建EHV-8 gD960基因表达载体并获得gD重组蛋白,gD重组蛋白分子质量约为65 ku,与预期大小相符,且特异性良好。小鼠血清中鼠抗EHV-8 gD960多克隆抗体效价为1∶16 000,该多克隆抗体可以与EHV-8 gD960蛋白发生免疫反应。说明成功表达了EHV-8 gD960重组蛋白并制备了多克隆抗体,多克隆抗体的效价较高,免疫原性较好。

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定

目的构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清。方法从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础。

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。

人高迁移率族B1的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的以原核表达的人高迁移率族B1(Highmobilitygroupbox1,HMGB1)蛋白为免疫原免疫日本大耳白兔,制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法将人HMGB1cDNA克隆于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导HMGB1表达,Ni2+-NTA层析纯化后,用其免疫兔。以ELISA检测抗体效价,Westernblot鉴定抗体特异性。结果成功表达并纯化了人HMGB1蛋白,纯化后纯度可达96%;ELISA法测定抗体效价为1∶25600;Westernblot结果显示所制备的抗体可特异性与人HMGB1蛋白结合。结论成功制备了兔抗人HMGB1多克隆抗体,为进一步研究HMGB1与相关疾病的关系打下了基础。

兔抗人copine-8蛋白多克隆抗体的制备

目的制备人源copine-8(CPNE8)蛋白的多克隆抗体。方法反转录PCR扩增HBE人支气管上皮细胞的CPNE8基因(编码CPNE8蛋白)并克隆至p GEX-4T-1原核表达载体中,所得的重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白。谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化目的蛋白并基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。以纯化的CPNE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法检测抗体的效价和特异性。结果成功构建了p GEX-4T-1-CPNE8表达载体,重组CPNE8蛋白在大肠杆菌中高效表达。ELISA检测结果显示抗体的效价达1∶64 000;此多克隆抗体可经Western blot特异性识别原核表达的CPNE8蛋白,并可适合免疫组织化学技术检测该蛋白在人正常肺组织和肺癌组织中的分布。结论成功制备具有较好结合特异性的CPNE8蛋白多克隆抗体。

淇河鲫IL-8原核表达系统的构建及多克隆抗体的制备与鉴定

为揭示淇河鲫(Carassius auratus var.Qihe)白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的功能,本研究构建了原核表达系统,并制备了兔抗鲫IL-8多克隆抗体。首先采用RT-PCR法扩增淇河鲫IL-8基因编码序列中不含信号肽的基因片段,克隆到pET-32a(+)载体后转化入Rosetta菌株构建原核表达系统。经IPTG诱导表达出相对分子质量约27.8 kD的目标融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,效价达1︰10~5。经免疫亲和层析纯化的抗体能特异性识别重组和天然的淇河鲫IL-8蛋白。比较不同组织的免疫组化和荧光定量PCR结果,IL-8蛋白量和mRNA的表达量在不同组织间变化趋势一致,在肌肉、脾和头肾均检测到较高的表达量,肠道的表达量较低。本研究为进一步探讨淇河鲫IL-8的生物学功能奠定了基础。

人PD1胞外段基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:研究人PD1的生物学活性,制备人PD1胞外段区域及其特异性抗体。方法:用PCR方法扩增编码人PD1胞外段的基因序列(hPD1ecr),将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化目的蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),流式细胞术检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a(+)-PD1ecr成功构建,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到的PD1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的人PD1胞外蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下人PD1蛋白,为进一步研究PD1功能奠定了实验基础。

人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位

目的原核表达人VIGILINN端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位。方法用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。产物经Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILINN端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性。通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布。结果在28℃1、mmol/L IPTG诱导3 h的最优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1∶16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域。结论成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础。

人血白蛋白的原核表达及应用

旨在构建人血白蛋白(HSA)基因的原核表达载体pGEX-4T-1-rHSA,诱导表达后纯化重组HSA蛋白,制备多克隆抗体并对其进行鉴定。根据GenBank发表的HSA(NM_000477.5)的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以人胚肺二倍体细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增HSA基因,将其克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-rHSA,经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经变性、复性、亲和层析纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果表明,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,分子质量为92 kD;重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性;应用其制备的抗血清效价达到1∶100 000;纯化的多克隆抗体与血源人血清白蛋白和重组人血白蛋白均能产生特异性结合,具有良好的生物学活性。

11型HPVE7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV11E7蛋白的多克隆抗体。方法构建pGEX-4T2-HPV11E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11E7,纯化获取11型HPVE7蛋白。将HPV11E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体。Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性。结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6 h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11E7融合蛋白。纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体。Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点。结论成功表达了HPV11E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11E7蛋白多克隆抗体。

人GITR_(aa27-165)蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:表达和纯化人GITR胞外段(hGITRaa27-165)融合蛋白,制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb)。方法:利用PCR从pGEMT-hGITR获得hGITRaa27-165编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pQE30,构建重组表达质粒pQE30-hGITRaa27-165;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,通过Profinity IMACNi-Charged Resin亲和层析柱进行纯化;纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果:构建了pQE30-hGITRaa27-165原核表达载体,原核蛋白hGI-TRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白,蛋白浓度为400mg/L,制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1∶1.6×105,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论:获得高纯度hGITRaa27-165蛋白,并制备特异性pAb,将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础。

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21(DE3)pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1∶20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。

人星状病毒1型衣壳蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体制备的研究

目的表达纯化人星状病毒1型(HAstV-1)衣壳蛋白VP26片段,制备多克隆抗体,初步建立夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)检测病毒抗原方法,为进一步大量表达VP26片段、构建基因工程疫苗和临床检测奠定基础。方法利用原核表达系统在大肠杆菌中克隆、表达重组VP26蛋白,并以Ni2+-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,运用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二噻啉甲酸法(BCA)实验、Western blot等方法对重组蛋白纯度、浓度、抗原性进行评价鉴定。以重组VP26蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳兔获得多抗血清并对其效价、特异性用ELISA鉴定。结果原核表达载体pET30a(+)-VP26构建成功,重组VP26蛋白可在大肠杆菌Rosetta 2宿主菌中大量表达。免疫兔所得多抗血清效价达到1∶8 000,可以满足夹心法ELISA实验的需要。结论HAstV-1衣壳蛋白原核表达系统建立和多克隆抗体制备可以作为今后相关研究的基础,有助于对HAstV-1感染致病机制、免疫诊断和疫苗研制的更深入研究。

人CD96基因胞外区的原核表达及抗血清制备

目的原核表达并纯化人CD96胞外区蛋白,免疫家兔制备抗体。方法构建pET32-CD96重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂纯化蛋白并免疫家兔,以间接ELISA检测抗体效价,Westernblot鉴定抗体特异性。结果质粒pET32-CD96经测序鉴定,通过SDS电泳显示能在BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约37000;Westernblot实验结果显示制备的多克隆抗体可与HL-60细胞提取蛋白及原核表达的人CD96蛋白胞外区特异性结合。结论成功构建并表达人CD96胞外区蛋白,免疫家兔获得高滴度抗血清,为后续研究奠定了基础。

人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别

【目的】构建人类Foxm1b基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,并用此抗体检测肝癌细胞中Foxm1b基因的表达,为进一步研究Foxm1b基因的功能奠定基础。【方法】从GenBank中下载人类Foxm1b基因全长cDNA序列并用Pcgene软件分析其可能的抗原表位,设计引物,应用RT-PCR获得含抗原表位的Foxm1b基因片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度并用免疫细胞化学的方法检测此抗体对肝癌细胞中天然Foxm1b蛋白的识别。【结果】成功构建了Foxm1b基因重组表达载体pET-28a-Foxm1b,表达的蛋白经纯化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗体,该抗体可以识别肝癌细胞中的天然抗原。【结论】人类Foxm1b基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及有诊断价值的抗体的制备为后续的研究提供了基础。

人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:在原核系统中表达并纯化人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白,制备多克隆抗体。方法:设计引物扩增其开放阅读框,重组入原核表达载体PQE30,并在大肠杆菌M15中诱导表达;应用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔。结果:①成功构建人类组氨酰TRNA合成酶类似物的原核表达载体;②经NI亲和层析获得纯度较高的重组蛋白;③制备了高滴度的兔抗人类组氨酰TRNA合成酶类似物蛋白的多克隆抗体。结论:原核表达载体的构建、重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备为今后研究该蛋白的功能提供了良好的基础。

人乳头瘤病毒16型E7密码子优化后的原核表达及免疫原性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因密码子优化后的原核表达系统,通过特异性抗体制备评价E7融合蛋白的免疫原性。方法人工合成优化后的HPV16 E7基因,利用特异引物扩增HPV16 E7基因。将E7基因连接至原核表达载体构建重组表达质粒pMAl-c2X-E7,转化至感受态细胞DE3后,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物E7融合蛋白。纯化后的E7融合蛋白免疫动物,采用ELISA检测动物血清效价。结果 E7基因PCR产物的测序结果与优化后的目的基因序列比对一致。表达的E7融合蛋白经SDS-PAGE分析表明:在相对分子质量50 000处有特异性表达带,与预期相符。以E7融合蛋白制备的多克隆抗体其血清效价可达1∶64 000。结论成功构建的重组表达质粒pMAl-c2X-E7可有效表达MBP-E7融合蛋白,E7融合蛋白具有良好的免疫原性。

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的:采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔,制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法:利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达,纯化hIL-24重组蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE分析,同时提取hIL-24真核重组质粒,用以免疫新西兰兔,并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性,ELISA法测定抗体效价。结果:人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达,表达量占细菌总蛋白的30%,纯化后的蛋白纯度高;原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔,通过抗体效价测定,获得了抗血清效价达1∶640的多克隆抗体。结论:原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体,其多克隆抗体的效价较高。

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础。方法从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不含信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度。结果成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体。结论成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础。