猪VⅢ因子A1和A3结构域对翻译后剪接的人/猪杂合VⅢ因子的促分泌作用

凝血VⅢ因子(fVⅢ)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fVⅢ基因的甲型血友病基因治疗的不利因素。本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明,运用双载体共转fVⅢ基因,通过翻译后蛋白质剪接,轻链可顺式促进fVⅢ蛋白的分泌。本文用猪fVⅢ蛋白的A1和A3结构域替换人fVⅢ蛋白相应的结构,构建人/猪杂合fVⅢ(human/porcinehy-bridfVⅢ,HP-fVⅢ),研究基于内含肽的双载体转HP-fVⅢ基因后剪接HP-fVⅢ的分泌和活性。构建一对分别融合SspDnaB内含肽的HP-fVⅢ重链和轻链基因表达质粒,瞬时共转染COS-7细胞,用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中HP-fVⅢ的剪接和生物活性,用Western blotting检测了细胞内HP-fVⅢ的剪接。结果显示,双载体转HP-fVⅢ基因细胞上清的剪接HP-fVⅢ蛋白量为(184±34)ng/mL,活性为(1.18±0.22)IU/mL,明显高于双载体转人fVⅢ基因[蛋白量为(48±12)ng/mL,活性为(0.31±0.10)IU/mL],提示猪fVⅢ的A1和A3结构域能显著促进内含肽剪接的HP-fVⅢ的分泌和活性;另外,还在混合培养的分别转内含肽融合HP-fVⅢ重链和轻链基因细胞上清中检测到剪接的HP-fVⅢ蛋白量为(27±5)ng/mL,活性为(0.19±0.07)IU/mL,提示内含肽对HP-fVⅢ的剪接可不依赖细胞机制,分泌出胞的前体蛋白仍可进行剪接反应;双载体转HP-fVⅢ基因细胞内检测到与转hfVⅢ基因阳性对照细胞内hfVⅢ条带大小接近的剪接HP-fVⅢ蛋白条带,进一步证实HP-fVⅢ的剪接。该结果为进一步在动物体内应用内含肽的双腺相关病毒载体转HP-fVⅢ基因奠定了实验基础。