miR-126对EA．hy926细胞血管内皮生长因子表达的调控作用

目的:探讨miR-126对EA.hy926细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:选用EA.hy926细胞株作为研究对象,采用阳离子介导的转染方式,将miR-126 inhibitor和miR-126 mimics进行细胞转染,分析miR-126对血管内皮细胞功能的影响。采用转染negative control作为阴性对照,转染36 h后提取细胞总RNA,利用real-time PCR和Western blotting分别检测EA.hy926细胞VEGF mRNA和蛋白水平的表达。结果:转染miR-126 inhibitor 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间差异有统计学意义(P<0.01),与阴性对照组相比,miR-126 inhibitor使EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平显著上调(P<0.01);转染miR-126 mimics 50 nmol/L 36 h后,EA.hy926细胞的VEGF mRNA及蛋白水平各组间有显著差异(P<0.01),与阴性对照组相比,miR-126 mimics使EA.hy926细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平显著下调(P<0.01)。结论:miR-126能够抑制VEGF的表达,VEGF有可能是其调节的靶基因之一。

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的EA.hy926细胞Bcl-2表达的影响

目的研究苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞株(EA.hy926)Bcl-2表达的影响。方法苦荞麦总黄酮作用于高浓度软脂酸刺激下的EA.hy926细胞,RT-PCR技术检测Bcl-2 mRNA表达水平,免疫组织化学方法检测Bcl-2蛋白的表达情况。结果与对照组相比,模型组细胞Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组相比较,苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01);苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。结论苦荞麦总黄酮可以促进EA.hy926细胞Bcl-2基因及蛋白的表达发挥抑制凋亡的作用。

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导EA.hy926细胞Bax表达的影响

目的探讨苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞株(EA.hy926)Bax表达的影响。方法苦荞麦总黄酮作用于高浓度软脂酸刺激下的EA.hy926细胞,RT-PCR技术检测Bax mRNA表达水平,免疫细胞化学方法检测Bax蛋白的表达情况。结果与对照组相比,模型组细胞Bax mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组相比较,苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞Bax mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01);苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。结论苦荞麦总黄酮可以降低EA.hy926细胞Bax基因及蛋白的表达,从而发挥抑制血管内皮凋亡的作用。

苞叶雪莲粗提物对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用

通过确定Na_2S_2O_4对EA.hy926细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型,以只加Na_2S_2O4为对照组,添加不同浓度的苞叶雪莲(Saussurea obvallata)粗提物,从细胞形态和细胞生存率两个方面检测其抗缺氧作用,分析苞叶雪莲粗提物对Na_2S_2O4造成EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用。结果表明,苞叶雪莲粗提物从1.25 mg/m L浓度开始呈剂量依赖性的增加了缺氧模型组中EA.hy926细胞的相对存活率,在10 mg/m L浓度下与Na_2S_2O4模型组相比,极显著增加了细胞存活率,是缺氧模型组的6.3倍,表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧损伤能力。

苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的EA.hy926细胞Bcl-2/Bax表达的影响

目的:研究苦荞麦总黄酮对软脂酸诱导的人脐静脉血管内皮细胞(EA.hy926)凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法:体外培养EA.hy926细胞,实验分为正常组、模型组、苦荞麦总黄酮组和二甲双胍组,用高浓度的软脂酸建立胰岛素抵抗状态血管内皮细胞损伤模型。采用western bolt检测Bcl-2及Bax蛋白的表达情况。结果:与正常组相比,模型组细胞Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2/Bax比值降低,差异有显著性(P<0.01);与模型组相比较,苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组细胞Bcl-2蛋白表达水平明显升高,Bax蛋白表达减少,Bcl-2/Bax比值明显提高,差异有显著性(P<0.01);苦荞麦总黄酮组与二甲双胍组之间无显著差异(P>0.05)。结论:苦荞麦总黄酮可通过调节Bcl-2/Bax表达而抑制软脂酸诱导的EA.hy926凋亡,减少内皮细胞损伤。

采用蛋白质组学技术研究罗布麻总黄酮抗EA.hy926细胞损伤作用机制

目的应用同位素标记的绝对与相对定量（iTRAQ）蛋白质组学技术联合Q-Exactive质谱仪对罗布麻总黄酮（total flavonoids of Folium ApocyniVenet,TFF）作用前后EA.hy926细胞的蛋白质表达谱进行检测,找出差异蛋白,并对其进行生物信息学分析,以探讨TFF抑制H2O2诱导的EA.hy926细胞损伤的作用机制.方法（1）采用MTT法检测TFF各浓度的细胞毒性和最有效剂量.（2）分别提取正常组,模型组,罗布麻总黄酮组蛋白,酶解后用不同的iTRAQ试剂标记,混合后采用Q-Exactive质谱仪鉴定,并用PD（Proteome Dis-coverer1.3,thermo）和mascot2.3.0进行定性和定量分析,筛选差异表达蛋白并对其进行生物信息学分析.结果（1）36mg·L^-1的TFF能较好的减少H2O2导致的细胞凋亡.（2）实验共鉴定出蛋白3628个,以两组比值≥1.2或≤0.8为差异蛋白定量标准,H2O2刺激后导致其中250个蛋白表达发生变化（两组比值〉1.2倍或〈0.8倍）,经TFF治疗可改善87个蛋白的异常表达趋势,其中上调54个,下调33个,包括血红蛋白δ亚基（HBD）,硫氧还蛋白结构域蛋白15（TXD15）,溶质载体家族12成员6（S12A6）,组织因子途径抑制物（TFPI）,血小板衍化生长因子β（PA1B2）等蛋白.结论TFF能改变H2O2导致的差异蛋白表达情况,这些蛋白富集于细胞周期,细胞骨架,细胞凋亡等多种生物学功能,形成庞大的相互作用网络,协同发挥抗凋亡作用.

人EGFL7真核表达载体的构建及稳定转染EA.hy926细胞系的建立

目的建构对人类表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因真核表达载体以及稳定性转染EA.hy926细胞系的科学评价体系。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得EGFL7的开放阅读框(ORF),借助双酶切方式,使得EGFL7能够被克隆至真核表达载体(pEGFP-N1)中并获取到已经重组好的质粒pEGFP-N1-EGFL7。在进一步接受测序和鉴定处理后,借助电转仪对EA.hy926细胞进行转染,然后通过G418筛查进而建构起稳定性转染EA.hy926细胞系。使用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测EGFL7基因及蛋白在EA.hy926细胞系中的表达。结果转染EGFL7的EA.hy926细胞的EGFL7基因和蛋白水平均明显高于对照质粒转染组和空白对照组(P<0.05)。结论成功建构人EGFL7真核表达载体并鉴定了EGFL7在EA.hy926细胞系中的过表达,为探讨EGFL7对早产儿支气管肺发育不良的影响奠定基础。

丹红化瘀口服液含药血清对氯化钴诱导EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用

目的研究丹红化瘀口服液含药血清对氯化钴(CoCl_(2))诱导人脐静脉内皮细胞(EA.hy926细胞)缺氧损伤的保护作用。方法建立CoCl_(2)诱导EA.hy926细胞缺氧模型,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜观察细胞超微结构。试剂盒检测细胞上清液的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活力和丙二醛(MDA)水平,RT⁃PCR检测缺氧诱导因子⁃1α(HIF⁃1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达。结果5%~10%丹红化瘀口服液含药血清能增强缺氧损伤细胞的活力(P<0.05,P<0.01),抑制细胞凋亡(P<0.05,P<0.01),减轻细胞结构损伤,降低细胞MDA水平和升高GSH⁃Px水平(P<0.05,P<0.01),剂量依赖性地下调细胞HIF⁃1α、VEGF、VEGFR1、VEGFR2及iNOS mRNA表达(P<0.01)。结论丹红化瘀口服液含药血清通过抗氧化作用减轻氯化钴诱导的EA.hy926细胞缺氧损伤。

党参多糖对H_2O_2所致EA.hy926细胞氧化损伤的保护作用

目的研究党参多糖对低浓度过氧化氢(H2O2)刺激下EA.hy926细胞的保护作用。方法采用体外培养EA.hy926细胞,利用H_2O_2小剂量长时间刺激进行造模,并选用维生素E作为阳性对照组。采用MTT法检测细胞的增殖情况,光学显微镜观察细胞形态学的改变,SA-β-半乳糖苷酶染色法检测细胞的衰老水平,流式细胞术检测细胞周期,比色法检测细胞细胞培养上清中一氧化氮含量及细胞内的超氧化物歧化酶、丙二醛的含量,ELISA检测细胞培养基中内皮素-1、诱导型一氧化氮合酶、内皮型一氧化氮合酶的水平,DCFH-DA检测细胞内活性氧的水平。结果党参多糖各浓度组、维生素E组与模型组比较细胞的形态均有不同程度改善。与模型组比较,党参多糖各浓度组、维生素E组细胞的存活率升高,细胞G1期比例下降,SA-β-半乳糖苷酶染色的细胞蓝染率下降,超氧化物歧化酶、一氧化氮、内皮型一氧化氮合酶的水平升高,丙二醛、诱导型一氧化氮合酶、内皮素-1、活性氧水平下降。结论党参多糖可能通过提高EA.hy926细胞的抗氧化能力、调控内皮素-1与一氧化氮的动态平衡发挥其对氧化损伤的保护作用。

软脂酸对EA.hy926细胞一氧化氮合成的影响及六味地黄丸的干预效应

目的研究软脂酸(PA)对EA.hy926内皮细胞一氧化氮(NO)合成和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)表达的影响及六味地黄丸(LWDHP)含药血清的干预作用。方法将培养的EA.hy926细胞分组,采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAPDH)依赖性硝酸盐还原酶法测定细胞裂解上清液NO含量;RT-PCR及Western印迹检测细胞内eNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PA损伤的细胞裂解液中NO含量减少,与正常对照组比较差异显著(P<0.01)。2.5%LWDHP含药血清组NO含量进一步减少,5%、10%LWDHP含药血清组及二甲双胍(MET)组均能显著增加细胞裂解液中NO含量,与PA组比较有差异显著(P<0.01),但三者之间互相比较无显著性差异(P>0.05)。同时PA组细胞内eNOS mRNA和蛋白的表达显著减少(P<0.01),LWDHP和MET组细胞内eNOS mRNA和蛋白表达量增加(P<0.01)。结论 LWDHP含药血清能够刺激PA损伤的EA.hy926细胞eNOS mRNA和蛋白的表达,从而有效促进NO的合成,发挥其保护作用。

高糖高胆固醇诱导EA.hy926细胞凋亡中对HSPD1基因表达的影响

分析高糖(25 mmol/L葡萄糖)和胆固醇(3.2 mmol/L)诱导EA.hy926细胞凋亡对HSPD1基因表达的影响,结果表明,随胆固醇浓度增加,EA.hy926细胞活性下降,呈浓度依赖性.0.8 mmol/L胆固醇高糖培养液培养12 h的细胞活性与正常对照组(高糖培养液+0 mmol/L胆固醇)具显著性差异(P<0.01).低糖或高糖培养液+0.8 mmol/L胆固醇处理EA.hy926细胞不同时间后,细胞活性呈时间依赖性下调,48 h后细胞大部分变圆,脱落.高糖高胆固醇处理的细胞大部分发生凋亡(50%),HSPD1基因表达显著上调.

汉滩病毒感染EA.hy926细胞上调固有免疫相关分子表达的研究

目的探讨汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)感染EA.hy926细胞诱导抗病毒固有免疫相关分子的表达,为建立HTNV感染的细胞模型提供依据。方法将HTNV感染EA.hy926细胞,利用间接免疫荧光和实时荧光定量PCR技术于不同感染时间段,检测EA.hy926细胞中模式识别受体、细胞因子及抗病毒相关分子的mRNA表达水平。结果HTNV感染EA.hy926细胞后,随着感染时间的持续,核蛋白mRNA相对表达倍数显著上调,且不同感染时间段差异具有统计学意义(P<0.05);与未处理组相比,HTNV感染EA.hy926后,Toll样受体3、RIG-I和MDA5模式识别受体mRNA相对表达倍数均显著上调(P均<0.05),IL-6、IL-10、IFN-β和CCL5细胞因子mRNA相对表达倍数均显著上调(P均<0.05),ISG15、MxA、OAS1、IFITM1和IFITM3抗病毒相关分子mRNA相对表达倍数均显著上调(P均<0.05)。结论HTNV感染EA.hy926细胞后,可上调抗病毒固有免疫相关分子的表达,该细胞可以作为体外HTNV感染的细胞模型。

苞叶雪莲中活性成分对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用

目的探究苞叶雪莲(Saussurea obvallata)中的活性单体成分对细胞缺氧损伤的保护作用。方法培养EA.hy926细胞,将其分为阴性对照组、缺氧组和给药组,阴性对照组每孔加入10μL生理盐水,缺氧组每孔加入100 mmol的Na2S2O410μL,给药组每孔加入100 mmol的Na2S2O410μL及10μL不同浓度的单体化合物,放入培养箱中培养24 h,采用CCK-8法观察细胞存活情况。结果阴性对照组细胞存活率为100%,缺氧组细胞存活率<20%,给药组细胞存活率>60%,且与剂量正相关。结论芦丁、槲皮素对EA.hy926细胞的缺氧环境有明显改善,对Na2S2O4处理的EA.hy926细胞缺氧损伤具有保护作用。

miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达

目的:构建微小RNA-186(miR-186)基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法:化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR(qPCR)法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果:测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×108TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×108TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低(P<0.01)。结论:成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。

复方当归注射液对叔丁基过氧化氢诱导的EA.hy926细胞氧化损伤的保护作用

目的:研究复方当归注射液对对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)氧化损伤的保护作用。方法:首先测定DPPH自由基及羟基自由基清除率,初步研究复方当归注射液的体外抗氧化能力;然后体外培养EA.hy926细胞,分为正常组、模型组(t-BHP组)和复方当归注射液处理组(各浓度复方当归注射液+t-BHP组),采用MTT法检测各组细胞活力,试剂盒比色法检测各组乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH-Px)含量。结果:复方当归注射液清除DPPH及羟基自由基有显著的清除效果,EC50值分别为20.88μL/mL,0.8211μL/mL。对比正常组,t-BHP(600μmol/L)可显著致EA.hy926细胞氧化损伤,经复方当归注射液预处理可显著提高EA.hy926细胞的活性,降低LDH释放量和MDA含量,提高SOD和GSH-Px活力,并呈明确的浓度依赖性。结论:复方当归注射液对t-BHP诱导的EA.hy926细胞氧化损伤具有保护作用。

益气消癥法方含药血清干预EA.hy926细胞MAPK信号转导通路ERK1/2表达的研究

目的研究益气消癥法方含药血清对EA.hy926细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路上细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达的影响,探索其抑制子宫肌瘤血管新生的作用机制。方法 SD大鼠随机分为:对照组,益气消癥法方高、中、低剂量(生药剂量24、12、6 g/kg)组,ig给药,每天给药1次,连续给药5 d,腹主动脉取血,分离血清,灭活、过滤除菌;体外培养EA.hy926细胞,随机分为6组:对照血清组、模型组及益气消癥法方高、中、低剂量血清组和氟维司群(ICI,阳性药)组,除对照血清组外,其余组别给予雌二醇(E2),诱导细胞增殖,制备子宫肌瘤血管模型;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)及Western blotting法检测MEK2和ERK1/2基因与蛋白的表达。结果模型组MEK2和ERK1/2基因与蛋白的表达水平明显高于对照血清组(P<0.01);与模型组比较,ICI和益气消癥法方高剂量血清组MEK2和ERK1/2表达水平显著降低(P<0.01)。结论益气消癥法方含药血清通过降调ERK1/2表达,阻断MAPK/ERK1/2信号转导,抑制雌激素诱导的血管内皮细胞增殖,减少子宫肌瘤血液供应。

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长曲线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多WebelPalade小体,而EA.HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色Image-Pro Plus 6.0软件进行分析EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为(2 234.02±78.78)、(4 138.80±594.01)。原代HUVECs的染色程度明显较EA.HY926细胞株高,差异有统计学意义(P<0.01)。EA.HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA.HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。

木犀草素对EA.hy926细胞Nrf2信号通路的激活作用及H_2O_2致氧化损伤的保护作用

目的研究木犀草素对人脐静脉内皮EA.hy926细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响,及对H2O2诱导的细胞氧化损伤的保护作用。方法将细胞分成对照组、H2O2处理组、阳性药物(莱菔硫烷)组、不同浓度(5、10、20、40μmol/L)木犀草素组和不同浓度木犀草素(5、10、20、40μmol/L)+H2O2组,采用ARE荧光素酶报告基因、Western blotting和qRT-PCR确证木犀草素对Nrf2信号通路的影响;荧光标记流式细胞仪检测内源性活性氧(ROS)水平;MTT法评价木犀草素对H2O2诱导的EA.hy926细胞的保护作用。结果木犀草素能够剂量依赖性地增强ARE荧光强度,上调Nrf2及其下游基因血红素加氧酶-1(HO-1)、抗氧化酶NAD(P)H醌氧化还原酶-1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的蛋白和mRNA表达,降低内源性ROS水平;采用木犀草素和H2O2协同处理细胞,可表现出保护作用。结论木犀草素可以激活EA.hy926细胞Nrf2信号通路,抑制H2O2诱导的细胞毒性,对EA.hy926细胞具有氧化损伤保护作用。

宣威肺癌高发区室内灰尘对A549和EA.hy926细胞存活率的影响

目的探讨宣威肺癌高发区室内灰尘对人体肺腺癌细胞株A549和人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy 926细胞存活率的影响。方法 A549和EA.hy 926细胞分别暴露于终浓度为10、25、50、100、200μg/ml室内灰尘溶液,PBS为溶剂对照,24h后,采用MTS法测定细胞存活率。结果室内灰尘均能抑制A549和EA.hy926细胞增殖(P<0.05),增加细胞死亡(主要为坏死),有剂量-反应关系。在相同染毒浓度下A549的存活率低于EA.hy926的存活率。结论体外实验发现宣威室内灰尘对A549和EA.hy926细胞均有细胞毒性,但A549细胞对宣威室内灰尘更为敏感。

厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926增殖、凋亡、VEGF mRNA表达的影响

目的:应用不同浓度厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy 926的增殖、凋亡生物学效应及血管发生主要基因VEGFmRNA的表达进行体外研究,探讨厄贝沙坦对内皮细胞的血管生成效应。方法:各种浓度厄贝沙坦对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926共同孵育24 h。细胞增殖采用CCK8法分析,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。RT-PCR验证VEGFmRNA的表达。结果:厄贝沙坦各浓度干预组细胞形态无明显变化,CCK8结果提示厄贝沙坦各干预组相比对照组细胞增殖活力增高(P<0.05),呈浓度非依赖性。流式细胞仪分析厄贝沙坦各浓度干预组细胞无明显凋亡。RT-PCR发现厄贝沙坦1×10-4,1×10-5,1×10-6mol/L浓度组VEGFmRNA表达增高(P<0.05)。结论:厄贝沙坦促进EA.hy926细胞株细胞增殖,上调VEGFmRNA的表达。这提示除了降压效应,血管紧张素受体拮抗剂在缺血性心脏病如慢性心力衰竭治疗中具有一定作用。