基于组学分析优化兽疫链球菌的透明质酸发酵生产

透明质酸具有保湿、润滑等多种生理功能,广泛应用于食品、医药和化妆品领域。目前透明质酸主要依赖于兽疫链球菌发酵生产。然而,遗传背景不清晰等问题,限制了兽疫链球菌作为底盘细胞的相关改造以及透明质酸发酵水平的提升。该研究首先对兽疫链球菌WSH-24的全基因组和转录组数据进行了测序分析,发现该菌株具有高效的糖酵解和乳酸合成能力,以及不完整的三羧酸循环和多种氨基酸合成途径的缺失。结合生长曲线分析,进一步明确该菌株为缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸4种氨基酸缺陷型。在此基础上,通过外源添加对应的氨基酸使透明质酸产量达到(2.65±0.02)g/L。其次,结合转录组测序数据,确定了维生素B5、维生素B7和维生素B12相关合成基因的转录水平过低。通过外源添加对应的维生素有效提高透明质酸的合成,使其产量达到(2.46±0.07)g/L。最后,通过培养基优化,在3 L发酵罐上透明质酸发酵质量浓度达到5.63 g/L,生产强度为0.31 g/(L·h),相较优化前提高了33.33%。该研究为进一步改造兽疫链球菌WSH-24奠定了基础,为透明质酸的产量提升提供了支撑。

透明质酸产生菌的紫外诱变及摇瓶条件的优化

对马疫链球菌SH-0进行紫外诱变,筛选出溶血素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株SH-2,使透明质酸产量提高5倍;突变株经5次传代,其产酸量及HA的相对分子质量保持稳定.经过发酵条件的优化,确定最佳摇瓶条件是初始pH7.6,发酵温度37℃,发酵时间44h.

低能离子注入法选育透明质酸高产菌株

以一株兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)NN-7为出发菌株,利用30keV,剂量为8×1014N+/cm2氮离子进行诱变,筛选获得溶血素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株,经摇瓶发酵培养筛选获得一株透明质酸高产菌株SH-9,透明质酸产量达3.23g/L,相对分子质量达2.12×106,相对于原始菌株,透明质酸产量及相对分子质量分别提高了104.4%及35.9%。6代传代实验表明诱变后得到的高产透明质酸菌株具有较好的传代稳定性。低能离子注入法可作为有效的诱变手段用于透明质酸高产菌株的选育。

马疫链球菌SH-5生产透明质酸营养条件的研究

对Streptococcus equiSH-5生产透明质酸的营养条件进行了研究,摇瓶发酵实验表明该菌株的适宜氮源为酵母膏和牛肉膏以2∶1组成的混合氮源,在碳氮比为2∶1时有利于透明质酸的合成和菌体的生长;通过正交实验摸索出营养培养基的最佳配比为葡萄糖5%,酵母粉6.67%,牛肉膏3.33%,MgSO4.7H2O 0.1%,MnSO4.4H2O 0.02%,NaHCO30.3%,Na2HPO40.5‰,尿嘧啶0.08‰;添加0.05‰异甘草素对产酸有利。

复合诱变选育透明质酸高产菌株

以马疫链球菌AF-0为出发菌株,用LiCl结合紫外线及硫酸二乙酯(DES)进行复合诱变,涂布筛选培养基,从中筛选出溶血素和透明质酸降解酶的双缺陷型突变菌株,经摇瓶发酵考察得到一株产量较高的菌株C4,并经多次传代,其遗传性基本稳定,但随传代次数增多,HA产量有下降趋势;其透明质酸产量达3.32g/L,分子量达1.45×106u,相对于原始出发菌株,产量及分子量分别提高了78%和40%。

透明质酸产生菌种的筛选

从实验室和临床菌种中分离到一株透明质酸产生菌，定名为马链球菌ＳＩＰＩ１．７２８。该菌的发酵液经分离纯化得白色纤维状固体产物，其理化性质、ＵＶ、ＩＲ和１ＨＮＭＲ图谱与透明质酸相符。

透明质酸的发酵调控研究

采用马链球菌 (Streptococcusequi)进行发酵生产透明质酸 (hyaluronicacid ,HA) .5L发酵罐发酵研究表明 :发酵调控对HA的产量和分子量有较大的影响 ,采用 2 0 g·L- 1的初始葡萄糖浓度及维持培养过程 2 0 g·L- 1的糖浓度 ,补加 5 g·L- 1的硫铵 ,采用一定的 pH控制策略可使HA的产量达到 1.0 g·L- 1,分子量在 2 .84× 10 6 Da以上 .

透明质酸补糖分批发酵工艺研究

采用马链球菌(Streptococcus equi)在7L自动发酵罐中进行分批补加葡萄糖发酵生产透明质酸(HA)。结果表明:采用葡萄糖初始浓度为35g/L,分批补加葡萄糖,使其浓度控制在20g/L～25g/L,通气量固定1.5L/min,通过调节搅拌转速(170r/min～300r/min)使发酵中后期溶氧控制在10%,可使HA的产量达到5.6g/L,平均分子量达到1.78×106u,较分批发酵时HA产量提高90%,分子量提高46%。

ARTP诱变筛选高产透明质酸菌株

透明质酸(HA)是一种由N-乙酷葡萄糖胺(GIcNAc)和D-葡萄糖醛酸(GlcA)以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接组成的高聚合大分子黏性多糖,具有极强的保湿作用,被称为理想的天然保湿因子,是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。马疫链球菌是目前透明质酸生产的主要菌种。菌株诱变是提升菌株性能或提高代谢产物的常用方法。采用ARTP对菌株进行诱变,通过改良CTAB比浊法进行菌株高通量初筛和摇瓶复筛,显著提高了透明质酸生产能力。经过3轮ARTP迭代诱变和筛选,最终使菌株HA产量提高了28.7%。

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。

构建无抗性标记双拷贝透明质酸合成酶基因工程菌

【目的】探讨一种构建无抗生素选择标记链球菌透明质酸合成酶基因工程菌的方法。【方法】PCR扩增链球菌透明质酸合成酶操纵子hasABC基因,用温度敏感载体pJR700构建携带hasABC基因重组质粒pXL32;电转化pXL32质粒到马链球菌兽疫亚种感受态细胞,卡那霉素(Kanamycin,kan)平板37℃培养筛选重组子,在不含kan液体培养基中30℃传代,37℃平板分离挑取抗生素敏感菌落,RT-PCR检测工程菌染色体hasABC基因表达,Bitter-Muir法测定菌体透明质酸含量。【结果】在无抗生素选择压力条件下,获得透明质酸产率提高34%的马链球菌兽疫亚种透明质酸合成酶基因工程菌。【结论】用pJR700温度敏感载体系统,构建能提高透明质酸产量的无抗生素选择标记的基因工程菌是可行的。