常年性和季节性发情绵羊品种HIOMT基因的PCR-SSCP分析

【目的】探讨季节性与常年性发情绵羊品种在HIOMT基因序列上的差异,为培育常年性发情绵羊品种提供辅助选择标记(MAS)。【方法】采用基因克隆测序及PCR-SSCP技术,分析小尾寒羊、新疆细毛羊、多浪羊和阿勒泰羊共计179个个体的羟基吲哚-氧-甲基转移酶(HIOMT)的3′非翻译区部分序列及其遗传多样性。【结果】在HIOMT基因的3′非翻译区存在PCR-SSCP多态,共发现AA、BB、CC、AB、AC和BC 6种基因型,在小尾寒羊群体中发现以上6种基因型,在新疆细毛羊群体中发现除CC基因型外的其他5种基因型,在阿勒泰羊群体中发现AA、BB、AB和BC 4种基因型,在多浪羊群体中只发现了AA、CC和AC 3种基因型。与AA基因型相比,BB基因型在第94,95,96和201 bp 4处发生了突变,CC基因型在第94,201和217 bp 3处发生了突变。Hardy-Weinberg平衡检验显示,小尾寒羊和多浪羊群体处于平衡状态,新疆细毛羊和阿勒泰羊群体处于非平衡状态。小尾寒羊、新疆细毛羊和阿勒泰羊群体多态信息含量为高度多态(PIC>0.5),多浪羊群体为中度多态(0.25<PIC<0.5)。经χ2独立性检验后,常年性发情的小尾寒羊和多浪羊与季节性发情的新疆细毛羊和阿勒泰羊群体间基因频率差异极显著(P<0.01)。【结论】HIOMT基因在不同绵羊品种中序列的差异性,可能是造成其季节性和常年性发情的原因之一。

冬夏季节变化对大鼠松果腺中褪黑素合成限速酶AANAT、HIOMT活性的影响

目的:观察在生理状态下,季节变化对松果腺中AANAT和HIOMT活性的影响。方法:选用健康雄性SD大鼠,分别在夏至,冬至前5周购入,饲养至冬至日和夏至日,放免测定法测定其血清褪黑素,同位素标记的酶活性测定法测定松果腺中AANAT和HIOMT活性。结果:在自然冬夏条件下,大鼠血清褪黑素和松果腺中AANAT酶活性在冬季较高,任一冬季组(20052、006年冬)与任一夏季组(20052、006年夏)相比均有显著性差异(P<0.05);两年内冬夏节律一致。褪黑素含量的冬夏变化规律与AANAT活性规律一致。HIOMT活性在冬季较高,夏季较低,有冬高夏低趋势,但其差异无统计学意义。结论:AANAT酶活性存在着季节性节律,血清褪黑素含量与松果腺AANAT活性冬夏变化存在正相关。HIOMT可能参与褪黑素合成节律的调节,不过作为最后一个转化酶,它的作用在于起到限制性调节的作用。

牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT基因CDS序列的比较

褪黑激素(MLT)是调控动物季节性生殖等多种生物节律,具有复杂生理功能的一种吲哚类激素,羟基吲哚-氧-甲基转移酶(hydroxyindole-O-methyltransferase,HIOMT)是决定MLT合成波动模式的重要酶之一。采用RT-PCR法克隆并分析了牦牛、犏牛和藏黄牛HIOMT基因的CDS序列。牦牛该基因序列连续缺失123bp,通过与普通牛基因组序列比对,该缺失片断位于HIOMT基因7个外显子中的第6外显子。由于克隆所得牦牛基因组DNA相应序列未缺失上述片断,推定所获得的牦牛HIOMT基因CDS序列属可变剪接体;克隆犏牛HIOMT基因获得长、短两条件序列,长序列与藏黄牛、普通牛该序列相似,短序列与牦牛相似,但尚不能确定这两条序列各自来自父本还是母本;与普通牛HIOMT基因比较,牦牛、犏牛和藏黄牛分别有11、13(长序列17)和11个变异位点,且位于密码子第1、2位点的变异分别为4、6(7)和4个,均为非同义突变,所有非同义突变只有1处由密码子第3位变异引起,这些突变可能通过影响蛋白结构进而影响其生物学功能。还预测了牦牛、犏牛、藏黄牛和普通牛HIOMT蛋白相对分子量、理论等电点、疏水性、跨膜区等。HIOMT的保守性较强,是系统进化研究较理想的分子标记。

褪黑激素对香港细首纽虫(Cephalothrix hongkongiensis)性腺发育的影响及羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)的测定

本文研究了去头术和外源褪黑激素对香港细首纽虫(Cephalothrix hongkongiensis)性腺发育的影响,并对褪黑激素合成酶HIOMT进行了Western blot测定和免疫组织化学定位。结果表明,去除头部可快速诱导香港细首纽虫的性腺发育,处理40天后配子完全成熟,而对照组(完整个体)在整个实验过程中均未发现性腺。这说明香港细首纽虫头部具有抑制性腺发育的物质(激素)。外源褪黑激素对香港细首纽虫的性腺发育有显著的抑制作用,并且随着浓度的升高,抑制作用增强。Western bolt结果显示,在38k Da处有阳性条带;免疫组织化学定位发现,脑神经节的几个神经细胞有阳性反应,说明香港细首纽虫的脑神经节中存在HIOMT,具有合成褪黑激素的功能。

绵羊甲状腺自主合成并分泌褪黑素的研究

本研究旨在探讨绵羊甲状腺是否表达催化褪黑素合成的关键酶基因AANAT、HIOMT以及褪黑素受体基因MT1,并自主合成和分泌褪黑素,为研究甲状腺在绵羊季节性繁殖中的功能奠定基础。利用RT-PCR、组织免疫荧光、细胞免疫荧光和ELISA技术,分别在基因、蛋白质和细胞水平对绵羊甲状腺中合成褪黑素的关键酶基因AANAT、HIOMT以及褪黑素受体基因MT1的表达、细胞定位以及褪黑素的合成与分泌进行了研究。结果表明:绵羊甲状腺表达褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT和褪黑素受体基因MT1,并能够自主合成和分泌褪黑素。该研究首次证实了绵羊甲状腺具有自主合成并分泌褪黑素的功能,表明甲状腺内部可能存在有通过褪黑素调控甲状腺素合成的新通路,为进一步研究绵羊甲状腺自主合成褪黑素的功能奠定了基础。

褪黑素合成酶在绵羊胃中的表达

旨在了解绵羊各胃中褪黑素的合成情况。采取绵羊瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃和皱胃等5个部位,用免疫组化、Western blot、RT-qPCR等方法,探讨褪黑素合成的关键酶AANAT和HIOMT在不同胃的定位和相对表达情况。结果表明,AANAT和HIOMT蛋白在绵羊各胃均有分布,且在各胃的黏膜层呈强阳性表达,其中在皱胃的表达量最高,AANAT在瘤胃背囊和瘤胃腹囊的表达量最低,而HIOMT在瘤胃背囊的表达量最低;AANAT和HIOMT mRNA水平均显示在网胃最高,其中AANAT在瘤胃背囊和瓣胃表达最低,而HIOMT在皱胃中表达最低。综上所述,在绵羊不同胃中均有AANAT和HIOMT的表达,并且AANAT和HIOMT存在表达差异,说明绵羊胃也具有自主合成褪黑素的功能,提示褪黑素可能通过自分泌和旁分泌的作用方式对绵羊胃功能活动进行调控,为进一步研究褪黑素对绵羊胃功能的调控作用机制提供了理论基础。

褪黑素合成酶ASMT基因过表达奶山羊生物安全评价研究

为了研究乳腺过表达褪黑素合成限速酶乙酰血清素甲基转移酶(ASMT,HIOMT)基因奶山羊的生物安全性,试验针对乳腺过表达褪黑素合成酶ASMT基因奶山羊模型,记录了转基因山羊的生长发育数据、检测了血液及尿液中生理生化指标,并对肠道微生物、乳成分及褪黑素含量进行分析。结果表明:1)转基因阳性羊0,3,6,12月龄体重、体长、身高和胸围四项生长指标和对照羊均无显著差异(P>0.05);2)转基因阳性羊体温、胆固醇、血糖、总蛋白和各类型细胞含量及尿液中蛋白质、葡萄糖含量等指标与对照羊无显著差异(P>0.05);3)16S r DNA菌群测序结果表明,转基因阳性羊与对照羊肠道微生物群落组成及优势菌群均无显著差异(P>0.05);4)转基因阳性羊褪黑素含量显著高于对照羊(P<0.05),且乳中褪黑素含量显著高于血液(P<0.05),转基因阳性羊乳中乳蛋白和干物质含量显著高于对照羊(P<0.05),转基因阳性羊体细胞数显著低于对照羊(P<0.05)。说明乳腺过表达褪黑素合成限速酶ASMT基因不影响转基因奶山羊健康,而且会提高奶山羊乳品质。

六味地黄方体外对人正常黑素细胞中褪黑素合成限速酶ANNAT、HIOMT活性的影响

目的观察六味地黄方对体外培养的人正常黑素细胞中ANNAT、HIOMT活性的影响。方法体外培养人正常黑素细胞,CCK-8法测药物法测定不同浓度的六味地黄方含药血清对黑素细胞增殖的影响,实时荧光PCR定量法测定不同浓度的六味地黄方含药血清对黑素细胞中ANNAT、HIOMT活性的影响。结果六味地黄方对于黑素细胞的增殖药物剂量的增加先促进了黑素细胞的增殖,在中剂量达到最高(P<0.05),继而高剂量组药物抑制其生长(P<0.05)。AANAT活性在低剂量组及中剂量组表达下调,与低中剂量促进黑素细胞增殖情况一致。分析结果表明,六味地黄方体外对黑素细胞增殖与AANAT活性存在相关性,且差异有统计学意义(P<0.05)。但六味地黄方含药血清对黑素细胞各用药剂量组HIOMT的mRNA含量无明显变化。结论 AANAT的活性在六味地黄方体外对黑素细胞影响的过程中可能起到限制性调节作用。

季节变化对仓鼠褪黑素合成限速酶羟基吲哚-氧-甲基转移酶mRNA表达的影响

目的:比较自然与人工模拟的四季对褪黑素合成限速酶羟基吲哚-氧-甲基转移酶(HIOMT)影响的异同,为运用四时模拟系统模拟季节的可行性和可信性提供相关数据,进而为中医"天人相应"理论的研究提供新的途径。方法:采用四季模拟系统人工模拟季节,测定模拟季节组和自然季节组仓鼠松果腺中褪黑素合成限速酶HIOMT mRNA表达,并进行对比。结果:在自然条件下,仓鼠松果腺中HIOMT mRNA表达在冬季较高,冬季组和夏季组相比有显著性差异(P<0.05),春季组和秋季组相比没有明显差异;在四季模拟系统条件下,模拟冬季组高于模拟夏季组,且有显著性差异(P<0.05),春季组和秋季组相比没有明显差异,与自然条件下四季节律一致;模拟四季组HIOMT mRNA表达与自然四季组同期相比均无显著性差异。结论:应用四季模拟系统模拟自然季节较为成功,利用其模拟季节进行天人相应理论研究的思路具有可行性。