北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立

[目的]为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。[方法]本研究根据两种锈菌的28SrDNA基因序列设计若干组LAMP引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的基因组DNA为模板进行LAMP反应并完成特异性检测;首先建立初始LAMP反应体系,再进一步优化LAMP反应体系的组分和反应条件,加入羟基萘酚蓝实现可视化检测;最后确定检测体系灵敏度。[结果]表明,筛选出的引物具有特异性;25μL北美栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg^(2+)浓度为6 mmol·L^(−1),最佳内外引物比例为8:1,最佳dNTPs浓度为1.2 mmol·L^(−1);同样地,25μL松杨栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg^(2+)浓度为4 mmol·L^(−1),最佳内外引物比例为6:1,最佳dNTPs浓度为1 mmol·L^(−1)。加入160μM羟基萘酚蓝(HNB)可清晰地指示反应结果,两种检测体系在61℃条件下,分别反应30 min和40 min可实现目视判断结果,且灵敏度分别可达34 fg·μL^(−1)和60 fg·μL^(−1)。[结论]通过建立两种锈菌的可视化LAMP-HNB检测体系可实现对北美栅锈菌和松杨栅锈菌进行区分及鉴定,为快速鉴定和区分重要杨树锈病提供了技术支撑和实践参考。

基于环介导等温扩增技术检测橡树疫霉菌

应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,然后经3种方法验证扩增结果:1)浊度仪验证浊度变化;2)琼脂糖凝胶电泳验证;3)在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定。特异性试验中,在橡树疫霉菌株中能够产生浊度曲线,扩增到梯形条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PrA3aPro-LAMP技术最低检测限为1 ng.μL-1。该方法的建立为橡树疫霉菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。

利用环介导等温扩增技术检测黑白轮枝菌

[目的]黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)能够危害苜蓿等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。[方法]基于LAMP技术,通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异,选取Tub(β-tublin,编码β-微管蛋白)基因作为靶标基因,设计并筛选了4条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和1条环引物,在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系,并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。[结果]特异性试验中,仅黑白轮枝菌菌株DNA扩增后呈天蓝色的阳性反应,而在其他真菌的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为1 pg·μL^(-1)。Tub-LAMP技术能够检测出发病苜蓿植物组织中的目标菌,在采自新疆的7份疑似样本中检测到3份阳性。在土壤中人工添加孢子的试验中,Tub-LAMP技术能够从每0.25 g土壤含有10个孢子和每10 g苜蓿种子含有50个孢子中检测出该病菌。[结论]该方法的建立为黑白轮枝菌的检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。

可视化环介导等温扩增技术在肺炎支原体检测中的应用

目的建立可视化肺炎支原体环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并对其敏感性和特异性进行验证,以期开发出适合各级医院和现场高通量检测的肺炎支原体试剂盒。方法克隆肺炎支原体P1基因质粒,并以此为模板建立LAMP体系,优化肺炎支原体LAMP体系的各组分和反应参数,添加反应指示剂羟基萘酚蓝,用已知浓度的肺炎支原体P1质粒检测体系敏感性;以相近种类支原体和细菌检测体系特异性。结果建立的可视化肺炎支原体LAMP体系能特异性检测肺炎支原体,检测限为2×102copies/m L。结论建立的可视化肺炎支原体LAMP检测体系可应用于人肺炎支原体检测,价格低廉,无需贵重仪器设备,操作简便,适合各级医院和现场高通量肺炎支原体检测。

肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速可视化检测

目的应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术和羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)指示剂建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7快速可视化检测方法。方法针对EHEC O157∶H7脂多糖编码基因rfbE保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料HNB作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,并评价检测方法的特异性和灵敏度。结果本方法最低检出限约为100拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅EHEC O157∶H7反应管HNB颜色由紫罗兰变成天蓝色,而肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均不发生变色反应;体系的扩增效率高于普通PCR,40 min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7现场快速检测。

等温扩增技术快速检测棕榈疫霉

【目的】棕榈疫霉是农林业生产上的一种危害严重的病原菌,建立棕榈疫霉的快速分子检测技术对于预测疫病发生情况、及时采取有效的防治方法控制疫病的传播和流行、减少经济损失具有重要意义。【方法】采用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了以基因间隔区(intergenic spacer,IGS)为靶标的快速、简单、特异和灵敏的棕榈疫霉菌的检测方法。以IGS基因为靶序列,利用环介导等温核酸扩增技术,设计了多组LAMP引物,同时建立并优化了LAMP反应体系与条件,最终筛选出1组扩增反应结果较好的LAMP引物,采用该组引物进行特异性、灵敏度和实际应用的验证。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化判定反应结果。【结果】整个检测过程在等温64℃条件下仅需80 min即可通过肉眼直接目测试验结果。在特异性试验中,通过HNB显色只有在棕榈疫霉菌株中能观察到天蓝色的阳性反应,而在其他疫霉、腐霉和真菌的供试菌株仍为紫色的阴性反应;在灵敏度试验中,PpIGS-LAMP技术检测灵敏度达到10fg.μL^(-1)目标菌纯DNA;在实际应用中,PpIGS-LAMP技术能够快速检测出采自田间的木薯根部土壤中目标菌和人工接种发病木薯组织样品的目标菌。【结论】本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测棕榈疫霉,建立了1种快速、高灵敏度、高特异性、可视化的棕榈疫霉的LAMP检测方法。建立的棕榈疫霉菌的LAMP检测方法在80 min内可完成待检样品的检测过程,显著缩短检测时间,降低基层部门的检测成本,为棕榈疫霉引起疫病的检疫和所致病害的快速诊断提供了新的检测技术。

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法.根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法.优化的反应体系为:1.6μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2μmol/L外引物(F3和B3),4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStartTMDNA聚合酶,120μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60℃,扩增时间60 min.在可视化LAMP体系中添加两条环引物(LF和LB)反应时间可缩短至20 min.该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.0103 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46株金黄色葡萄球菌和24株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性.本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术.

大豆茎褐腐病菌环介导等温扩增检测技术的建立

[目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。特异性试验中,大豆茎褐腐病菌菌株DNA扩增后HNB呈天蓝色的阳性反应,而在其他大豆常见病害的供试菌株中均呈紫色的阴性反应。在灵敏度试验中,ITS-LAMP技术最低检测限为10 pg·μL-1,对于进口大豆残体样本中PGS的检测灵敏度为每10 g大豆植株残体50个孢子。[结论]该方法的建立为检疫性病害大豆茎褐腐病菌的检测提供了新的技术平台,符合我国口岸对大豆茎褐腐病菌快速检测的迫切需要。

单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂,在不开盖进行凝胶电泳检测的情况下,可直接根据体系颜色变化判读结果,能够在20 h内(包括增菌时间)检测出样本中是否存在单增李斯特菌的RNA。本研究建立的RT-LAMP-HNB检测方法对单增李斯特菌RNA的检出限为5.8×10^-3μg/m L,起始接种浓度检出限为10 CFU/10 mL,灵敏度是RT-PCR的10倍,且能够检测出是牛奶中否存在的单增李斯特活菌,具有实际应用价值。本研究开发的检测方法具有快速、准确、便捷、灵敏度高等特点,适用于在基层或不便利地区推广使用。

叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×10~2 CFU/m L,人工污染肉制品的检出限为2.3×10~4 CFU/m L。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20份市售畜禽肉样,3种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。

畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究

目的:建立一种设备要求简单、结果可视化的用于定性检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的快速检测方法。方法:通过对羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)浓度、叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)浓度等的优化,结合环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立一种PMA-HNB-LAMP联用的可视化的用于快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的方法,对其特异性、灵敏度进行测试,并用于人工污染样品和实际样品的检测。结果:本研究成功建立了LAMP扩增体系,并通过添加210μmol/L HNB到LAMP扩增体系中,得到了差异明显的阴阳性结果。建立的HNB-LAMP法特异性强,其纯菌液灵敏度为104 CFU/mL,样品基质灵敏度为105 CFU/mL。本研究中用于处理样品的PMA浓度为10μg/mL,处理条件为室温下避光孵育5 min,曝光15 min。在检测人工污染的样品时,PMA-HNB-LAMP法和传统微生物法检测结果一致。结论:本研究成功建立了可快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的可视化PMA-HNB-LAMP法。

分光光度法测定烟叶中钙的研究

在弱碱性介质中，乳化剂－ＯＰ存在下，羟基萘酚蓝（ＨＮＢ）和钙生成蓝色２∶１ 络合物，λｍａｘ＝ ６５０ｎｍ ，ε＝ １．８６×１０４Ｌ·ｍ ｏｌ－ １·ｃｍ － １，钙含量在０－ ４０μｇ／２５ｍ Ｌ内符合比尔定律，本方法用于烟叶中钙的测定，结果令人满意。

一步法RT-LAMP-HNB检测兰花建兰花叶病毒和齿舌兰环斑病毒方法的建立

【目的】全世界兰花病毒有50余种,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿舌兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是其中最常见的两种病毒。目前仍没有有效的措施能够控制病毒病,因此建立针对病毒的高效监测、检测方法,对控制兰花病毒感染具有至关重要的意义。【方法】以兰花病毒CymMV和ORSV为试验材料,采用反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)进行病毒RNA的扩增,从而建立CymMV和ORSV的快速检测方法。分别根据两种病毒的cp基因序列保守区设计RT-LAMP引物,在一步法RT-LAMP反应体系中加入羟基萘酚蓝(HNB,终浓度200 μmol/L)作为扩增产物指示剂,不需开盖进行凝胶电泳检测,便可直接根据体系颜色变化判读反应结果。【结果】利用该检测方法能够在2 h测出样品中是否存在CymMV和ORSV病毒RNA,其灵敏度是RT-PCR的10倍。对20株田间样品进行一步法RT-LAMP-HNB检测,根据田间检测结果显示,CymMV检出率为70%,ORSV检出率为55%,与RT-PCR结果保持一致,该法适用于田间样品检测。【结论】建立的一步法RT-LAMP-HNB是一种灵敏、快速、特异、便捷的CymMV和ORSV检测方法,仅需要简单控温设备如水浴锅便可进行核酸扩增,适用于在基层或不便利地区推广使用。

Detection of nucleic acid of classical swine fever virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)

Classical swine fever virus (CSFV) is the causative agent of Classical swine fever which is a highly contagious disease affecting swine and resulting in severe economic losses. In this study, we developed reverse transcription loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay targeting the 5’UTR gene for the detection of CSFV. This amplification method can be obtained in 1 h under isothermal conditions (65°C) employing a set of six specific primers mixtures. Amplification product was visualized by using hydroxynaphthol blue (HNB) dye and agarose gel electrophoresis. The sensitivity was 100 copy numbers. No cross-reactivity related to Japanese encephalitis virus (JEV) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) was demonstrated. The results demonstrated that the RT-LAMP assay is a useful tool for the rapid and sensitive for CSFV detection in swine.

大肠埃希菌O157:H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的建立肠出血性大肠埃希菌O157︰H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法。方法针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157︰H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP法对O157︰H7rfbE基因的最低检出限约为100copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性。体系的扩增效率较高,可在40min内出结果。结论建立的基于颜色判定的EHEC O157︰H7LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157︰H7的快速检测。

新型布尼亚病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立新型布尼亚病毒(SFTSV)可视化快速检测方法。方法针对新型布尼亚病毒的S片段基因设计LAMP引物建立LAMP方法。反应体系内加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应扩增指示剂,根据LAMP浊度仪扩增结果优化反应条件,根据HNB颜色变化进行结果判定,评估LAMP方法的特异性和灵敏性。结果建立的LAMP方法最低检出限为10拷贝/反应管;方法的特异性高,仅SFTSV反应管颜色由紫罗兰变为天蓝色,而汉坦病毒、新疆出血热、Q热、马尔堡、埃博拉病毒及阴性对照反应管均未发生变色反应;LAMP反应的最佳温度为63℃,其扩增效率高于常规PCR,试验过程仅需30min。结论建立的可视化SFTSV LAMP检测方法具有特异性强,灵敏性高,实验设备要求简单等优点,可用于SFTSV的快速检测。

基于环介导等温扩增技术检测雪松疫霉根腐病菌

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker et Milbrath)是一种重要的毁灭性植物病原菌,也是我国进境植物检疫性有害生物。目前,我国未有该病害发生的报道,为了防止P.lateralis的传入和扩散,需对其进行快速、准确的检测。本文利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以Ypt1基因为靶标序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系,并对灵敏度和特异性进行检测。结果表明:整个检测过程仅需80 min,即可通过肉眼观察直接判定检测结果。在特异性检测中,P.lateralis菌株都能观察到天蓝色的阳性反应,而其他疫霉菌和真菌供试菌株均呈阴性反应。在灵敏度检测中,最低检测限为100 pg/μL。该方法的建立为P.lateralis的检疫鉴定及其所致病害的快速诊断提供了新技术。

应用环介导等温扩增技术可视化检测乙型肝炎病毒

目的 建立利用煮沸血清可视化检测乙型肝炎病毒（HBV）的环介导等温扩增技术（LAMP）方法. 方法 根据GenBank上提交的HBV的S基因序列比对后的相对保守区设计特异LAMP引物,分别用试剂盒法和煮沸法提取样本DNA.对反应条件进行优化,通过检测HBV标准毒株和临床样本来评价LAMP的特异性、灵敏度和抗干扰性,将实验结果和PCR进行比较.同时,对LAMP实验结果进行可视化检测.应用SPSS17.0软件进行一致性检验. 结果 建立了最适LAMP反应条件,LAMP特异性高,没有产生非特异性扩增.无论使用哪种核酸提取方法,LAMP灵敏度均为10拷贝/管.染料羟基萘芬兰（HNB）的灵敏度和电泳检测、SYBR Green Ⅰ效果相当,而不似染料SYBR Green Ⅰ容易造成气溶胶污染.另外,以荧光定量PCR （FQ-PCR）为金标准,煮沸法的LAMP和FQ-PCR具有的一致性较好（Kappa=0.762,P＞0.05）.然而,煮沸法的PCR和FQ-PCR的一致性较差（Kappa=0.186,P＜0.05）. 结论 LAMP在检测HBV感染中有优于PCR的特点,利用LAMP技术有利于在现场或基层医院检测HBV.

可视化环介导等温扩增技术检测Phytophthora tentaculata

为了能在植物发病早期快速、准确地鉴定出Phytophthora tentaculata引起的疫病,控制疫病的传播和流行,减少其造成的经济损失,笔者以Ypt1基因为靶序列应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal am-plification,LAMP),建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的P.tentaculata检测方法。结果表明:在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应80 min,反应后经2%琼脂糖凝胶电泳和扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果,在特异性实验中,P.tentaculata菌株能够扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而从其他疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象。在灵敏度试验中,PtYpt1-LAMP技术最低检测限为1 ng/μL。

基于Ypt1靶标的大豆疫霉环介导等温扩增技术的研究

大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL^(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。