丝状真菌转化载体的改进

为了改进农杆菌介导丝状真菌遗传转化用的Ti双元载体,将质粒pUCATPH上真菌trpC基因启动子驱动的潮霉素B抗性基因(hygB)表达盒转移到Ti质粒pPZP111上,构建成用于丝状真菌遗传转化的Ti载体pATZ。将植物表达载体pDL916上的草丁膦抗性bar基因重组到载体pKS-trpC上,构建成含真菌启动子、终止子调控的bar基因表达盒的中间载体pTrpCBar;之后将该表达盒转移到pPZP111载体上,得到以bar基因为筛选标记的真菌转化Ti质粒pTBZ。上述质粒载体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,为丝状真菌的农杆菌介导遗传转化提供了新的工具。

捕食线虫真菌的潮霉素抗性基因标记及其在土壤抑菌研究中的应用

用潮霉素磷酸转移酶基因(hygB)转化了捕食线虫真菌蠕虫节丛孢Arthrobotrysvermicola;转化率为1～3个转化子μg-1DNA;转化子的潮霉素抗性稳定性为87 5%。选取了一个潮霉素抗性稳定、生长和形态与原始菌株相似的转化子Tav36,研究了其在土壤中的生长及其对线虫的捕食,证明了此转化子能够在自然土壤中正常地生长和捕食线虫,但其生长速率和对线虫的致病能力受到了土壤抑菌作用的抑制。

三种捕食线虫真菌的REMI转化

采用REMI(restriction enzyme-mediated integration)技术,成功地用潮霉素磷酸转移酶基因(hygB)转化了捕食线虫真菌白色单顶孢(Monacrosporium candidum)、球状单顶孢(M. sphaeroides)和蠕虫节丛孢(Arthrobotrys vermicola)。这三种菌的转化率分别为10~18、25~35和0.2~3个转化子/μg DNA;它们的转化子的潮霉素抗性稳定性分别为12.5%、82.5%和87.5%。三种菌的野生型的生长在含有150μg/ml潮霉素的PDA培养基上完全被抑制,而它们的转化子一般都能在含有700μg/ml潮霉素的PDA培养基上正常生长。从每种菌中随机选择了40个转化子,在生长速率、菌丝形态、捕器形态及对线虫的捕食能力方面与野生型进行了比较,没有发现有明显差异。

稻瘟病菌致病突变体的REMI诱变与鉴定

以水稻“爱知旭”（Ａｉｃｈｉａｓｈａｈｉ）为寄主，将带选择标记的质粒ｐＣＳＮ４３和ｐＢＦ１０１为外源ＤＮＡ，利用限制酶诱导整合（ＲＥＭＩ）这种新方法转化稻瘟病菌原生质体，从筛选到的数百个转化体中分离出３个与致病能力密切相关的突变体Ｒ２Ｈ６５、Ｒ２Ｈ６９和Ｒ２Ｂ１５６５。其中，Ｒ２Ｈ６５和Ｒ２Ｈ６９只产生畸形分生孢子，分生孢子的发育和附着胞的形成以及黑色素的合成均受到极大影响，致病性测试证明完全丧失致病能力；Ｒ２Ｂ１５６５的许多表型与野生型的相似，但致病能力却大大降低。