猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌S4 0 74菌株毒素I的序列 ,设计了 1对引物 ,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I的结构基因 (apxICA) ,扩增的DNA片段大小为 36 4 0bp(4 6 87～ 832 6bp) ,将其克隆到pMD18 T载体中 ,酶切鉴定和序列测定后 ,进一步将其插入pET 2 8a中构建了原核表达载体 ,SDS PAGE和Westernblotting分析表明 ,该基因在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中获得了表达 ,而且表达的蛋白质具有免疫学活性。利用表达的蛋白作为抗原包被酶标板 ,建立了检测毒素I血清抗体的ELISA方法。临床应用表明 。

基于线粒体Cyt b基因和CO I基因序列研究豹蛱蝶亚科(鳞翅目,蛱蝶科)10属间的系统发生关系

测定了国产豹蛱蝶亚科10属共10个代表种的Cytb基因和COI基因的部分序列。结合从GenBank中获得的3个种类COI基因的同源序列,以锯眼蝶亚科2个物种为外群,通过遗传分析软件对COI、Cytb独立基因序列和联合基因序列以及编码的氨基酸序列进行了比较分析,同时用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)重建分子系统树,分析了该亚科10个属之间的系统发生关系。结果显示:1)联合基因序列的A+T平均含量为71.9%,具A、T偏倚性,其编码的357个氨基酸中没有半胱氨酸,变异率为11.5%;2)豹蛱蝶亚族为单系群;3)青豹蛱蝶属和豹蛱蝶属间、黄襟蛱蝶属和珐蛱蝶属间具有较近的亲缘关系;4)支持将文蛱蝶属、襟蛱蝶属和珐蛱蝶属从豹蛱蝶亚科中分离出来。

外源肉碱对鲤鱼背肌脂肪酸组成及其CPTI基因表达的影响

【目的】研究外源肉碱对鲤鱼背肌脂肪酸组成及其CPT I基因表达的影响,为阐明肉碱调控脂肪酸代谢的机理提供理论依据。【方法】在基础饲料中分别添加0,50,100,150,200和400mg/kg L-肉碱,进行饲养试验,60d后取鲤鱼(Cyprinus carpio)背肌样品,测定其脂肪酸组成;提取鲤鱼背肌总RNA,采用同源克隆方法扩增CPT I基因的部分序列,Real-time PCR方法测定CPT I基因mRNA表达水平的变化。【结果】外源肉碱对鲤鱼背肌脂肪酸组成有显著影响(P<0.05),随饲料中L-肉碱添加量的增加,鲤鱼背肌∑SFA和∑MUFA脂肪酸含量显著升高(P<0.05),∑PUFA、EPA、DHA、∑n-3和∑n-6脂肪酸含量显著降低(P<0.05);同源克隆扩增获得了鲤鱼CPT I基因的部分cDNA序列(GenBank注册号为JQ361077),长度为857bp,同源性分析表明其与斑马鱼(Danio rerio)的同源性为89%。鲤鱼饲料中L-肉碱添加量为150mg/kg时,CPT I基因mRNA的表达丰度最高,为对照组的4倍。【结论】本试验条件下,外源肉碱添加量为150mg/kg时,显著影响鲤鱼幼鱼背肌脂肪酸组成和提高CPTI基因mRNA表达水平。

日本囊对虾线粒体DNA CO I基因片段序列分析

以相应引物对日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因(mtDNA CO I)进行PCR扩增,经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序,得到709 bp的碱基片断.碱基组成A、C、G、T含量分别为196bp(27.64%)、129 bp(18.19%)1、34 bp(18.90%)、250 bp(35.26%).与GenBank中斑节对虾(Penaeus monodon)的mtD-NA CO I全序列(AF217843)比对,经分析发现:本实验获得的日本囊对虾mtCO I基因片段序列和GenBank上的同种序列(AY264897)都只是该种CO I基因序列的一部分,二者之间有41 bp的重叠并可拼接,拼接后的总长为1 515 bp.

大豆蚜捕食性天敌捕食行为的COI基因标记检测

【目的】探索大豆田捕食性天敌对大豆蚜的捕食作用。【方法】根据基因库NCBI中的一段大豆蚜细胞色素氧化酶I(COI)的基因序列(登录号为AY842503),设计了2对大豆蚜特异引物A和B,其扩增片段大小分别约为197和253 bp,应用DNA标记方法检测天敌对大豆蚜的捕食行为。【结果】种特异性检验表明,所设计引物只对大豆蚜DNA具有扩增效果,对与其同域发生的其它种类不具扩增作用;室内以引物对A与B分别检测喂食单头大豆蚜的异色瓢虫成虫和大草蛉成虫腹内靶标食物的衰变情况,结果表明,异色瓢虫成虫阳性比率的半衰期分别为喂食后3.371 h和2.814 h,大草蛉成虫分别为喂食后1.312 h和1.032 h;以A作为引物对田间捕食性天敌进行检测,结果表明,在所检测的7类群14种捕食性天敌中,5种不同种类或虫态的天敌对大豆蚜的捕食作用检出率高于50%,从高到低依次为异色瓢虫幼虫、草蛉成虫、东亚小花蝽若虫、异色瓢虫成虫、东亚小花蝽成虫;此外,田间检测表明,捕食性天敌的阳性比率与大豆蚜的种群密度呈显著正相关。【结论】DNA标记技术是探索捕食行为的有效方法之一。

凡纳滨对虾线粒体DNA COI基因片段序列

以相应引物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基基因(mtDNA CO I)进行PCR扩增,经过基因重组、转化、克隆、筛选、DNA测序,得到709 bp的碱基片段.碱基组成A、C、G、T含量分别为198 bp(27.93%)、136 bp(19.18%)、129 bp(18.19%)2、46 bp(34.70%).与果蝇(Drosophila yakuba)的mtDNA CO I全序列比对,经分析发现:本实验获得的凡纳滨对虾mtCO I基因片段序列和GenBank上的同种序列(AY264901)都只是基因序列的一部分,二者之间有41 bp的重叠并可拼接,拼接后的总长为1 515 bp.证明本实验条件下获得的mtCO I基因片段确实来自凡纳滨对虾线粒体DNA,且本实验所用引物具有通用性.

苏云金芽孢杆菌cry1I基因沉默的研究

分析了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry1和cry1Ⅰ基因的保守区,在cry1类基因的下游和cry1Ⅰ基因的上游设计了一对通用引物,用于检测cry1Ⅰ与cry1类基因的连锁现象,从鉴定的142株Bt分离株中,PCR扩增发现71株出现约1.4kb的阳性带,说明这一现象广泛存在于Bt菌株中,在此基础上用pGEM-T Easy载体克隆了菌株Bt07和J8中的连锁序列,序列分析表明,Bt07中是cry1Ⅰ基因与cry1Db基因连锁,间隔区为504bp;J8中是cry1Ⅰa基因与cry1Ac基因连锁,间隔区为506bp.进一步比较间隔区序列,同源性达93.7％,同时含有多个原核生物终止序列,且未发现启动子序列,揭示了这两个菌株中cry1Ⅰ基因沉默的成因。

特异性阻断诱导培养的大鼠破骨样细胞Atp6i基因的表达

目的筛选具有高效、高特异性地阻断体外诱导培养的大鼠破骨样细胞(osteoclast-like cells,OCL)Atp6i基因转录产物 mRNA翻译过程的siRNA序列。方法根据大鼠Atp6i基因序列设计2对siRNAs(Ⅰ、Ⅱ)序列,转染到各组体外培养第6天的OCL细胞内,转染组(Ⅰ或者ⅡsiRNA)T1组、阴性对照转染组(ⅢsiRNA)T2组、转染试剂转染组T3组以及空白对照组T4组;转染第24小时后,RT-PCR分析Atp6i mRNA的表达情况。结果Ⅰ号siRNA转染后,T1组中Atp6i基因RT-CR扩增产物密度值较其他组减少,差异明显(P<0.01),相对密度值较其他组也明显减少(P<0.01)。结论Ⅰ号siRNA片段特异性的抑制大鼠OCLAtp6i mRNA表达。

鸡钙蛋白酶I基因(CAPN1)多态性与鸡肉嫩度性状的相关性

为了探讨钙蛋白酶I基因(CAPN1)的多态性,并分析其对优良地方鸡种清远麻鸡和国外引进的隐性白羽鸡肌肉剪切力和系水力等性状的遗传效应,采用PCR-SSCP及测序的方法对CAPN1基因的编码区进行单核苷酸多态性(SNPs)扫描,并使用SAS软件进行最小二乘分析。发现了3个SNPs,分别为外显子5中的T2507C突变和C2546T突变,以及外显子6中的G3535A突变。各基因型与嫩度性状的方差分析结果表明:虽然各基因型在不同品种中表现出的效应存在差异,但趋势一致。结合CAPN1基因的生理功能和已有的研究结果来看,可在特定的群体中将其作为影响鸡肉嫩度性状的候选基因。

四种常见蚊虫的CO I基因分子进化分析

为了解无锡4种常见蚊虫的COI基因特征和蚊虫分子系统进化关系，对无锡淡色库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的COI基因序列进行扩增、测序，在GenBank中对序列进行同源性比对，分析基因特征、颠换率、遗传距离，利用MEGA4．1构建分子系统树。结果显示，4种蚊虫的COI基因序列扩增长度为699～717bp，GC含量为30．62％～32．49％，种间颠换率为11．74％-15．49％，种间遗传距离为0．121～0．151；每种蚊虫为单系群的支持值都为100。COI基因具有种属特异性，可以用于4种常见蚊虫的分类鉴别。

不同鸡品种IGF-I基因5′调控区TrulⅠ位点的多态性分析

胰岛素样生长因子-I是调节动物生命活动重要的多肽生长因子之一,它对动物的生长发育及代谢有重要的调控作用。本研究根据Gen Bank中发表的鸡胰岛素样生长因子I基因(IGF-I)的序列针对5′调控区的TrulⅠ位点设计1对引物。采用PCR-RFLP技术检测边鸡、京海黄鸡、尤溪麻鸡和AA鸡TrulⅠ位点的多态性,并试图探索Trul I位点的多态性和边鸡经济性状的关系。结果表明:边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡TrulⅠ位点存在多态性,而AA鸡不存在多态性;在京海黄鸡和尤溪麻鸡中形成AA、AB和BB 3种基因型,在边鸡中仅存在AA和AB基因型,基因型分布在4个鸡品种中并不一致。该位点能否作为边鸡经济性状的一个遗传标记有待进一步研究。

维生素D受体TaqI基因多态性与儿童肾病综合征骨代谢的相关性

目的研究维生素D受体TaqI基因多态性与儿童肾病综合征骨代谢标志物相关性,以期能否根据基因多态性预测儿童骨质疏松症风险,指导药物治疗及评估药物治疗的效果.方法研究对象为2015年5月至2016年11月收住昆明医科大学第一附属医院儿科的70例肾病综合征患儿,维生素D受体TaqI基因多态性检测方法为PCR扩增产物酶切后琼脂糖凝胶电泳检测,骨代谢标志物用生化分析.结果降钙素、25(OH)D3、甲状旁腺激素、钙、磷、碱性磷酸酶在维生素D受体TaqI基因3种基因型(TT,Tt,tt)之间的F值分别为:0.574,2.973,1.947,2.566,0.423,0.242,P值均大于0.05;镁在维生素D受体TaqI基因3种基因型(TT,Tt,tt)之间的F值9.278,P<0.001.在TT基因型患儿中,经骨化三醇治疗2周后与治疗前骨代谢标志物对比,降钙素、25(OH)D3、甲状旁腺激素、镁、磷、碱性磷酸酶t值分别为:0.796,0.290,0.295,0.574,0.830,0.933,P值均大于0.05;钙t值为4.301,P<0.001.在Tt基因型患儿中,经骨化三醇治疗2周后与治疗前骨代谢标志物对比,降钙素、25(OH)D3、甲状旁腺激素、钙、镁、磷、碱性磷酸酶t值分别为:0.722,1.298,1.391,1.511,1.671,1.045,0.368,P>0.05.在tt基因型患儿中,经骨化三醇治疗2周后与治疗前骨代谢标志物对比,降钙素、25(OH)D3、甲状旁腺激素、镁、磷、碱性磷酸酶t值分别为:1.168,1.755,1.787,2.344,1.777,1.808,P值均大于0.05;钙t值为2.458,P<0.005.结论在肾病综合征患儿中,维生素D受体TaqI多态性不能评估骨质疏松风险.TT基因型及tt基因型对骨化三醇治疗的反应性更好,经骨化三醇治疗2周后血清钙较治疗前有明显的升高,骨质疏松症的风险明显减低.

危害不同寄主云斑白条天牛不同世代线粒体CO I基因的序列比较

以危害白蜡树和杨树的云斑白条天牛2个寄主种群为研究对象,通过序列比对,分别比较危害不同寄主的云斑白条天牛雌、雄成虫线粒体CO I基因在2019和2014年2个世代个体间的碱基序列差异。结果显示:(1)云斑白条天牛的CO I基因在2019年和2014年世代个体间存在一定差异,CO I基因的部分碱基发生了变化,但开放阅读框的碱基没有改变。(2)在同一寄主种群内部,均为雄成虫CO I基因碱基序列变化大于雌成虫。危害白蜡树云斑白条天牛种群雌成虫CO I基因在2019年和2014年2个世代间的序列相似度为99.50%,雄成虫为99.20%;危害杨树云斑白条天牛种群雌成虫的序列相似度为99.5%,雄成虫为98.90%。(3)不同寄主种群之间,危害杨树种群CO I基因碱基序列变化大于危害白蜡树种群,危害白蜡树云斑白条天牛雌雄成虫CO I基因在2019年和2014年2个世代间的平均序列相似度为99.35%,危害杨树种群为99.20%。结果表明:危害白蜡树和杨树的云斑白条天牛雌、雄成虫不同世代个体间CO I基因的序列相似度存在差异,碱基发生了突变,雄成虫变化大于雌成虫,危害杨树种群变化大于白蜡树种群。

青海地区胃腺癌患者TGFβI基因的甲基化状态

目的通过检测青海地区胃腺癌患者癌组织及癌旁组织中的TGFβI基因启动子区域的甲基化状态,探讨TGFβI基因甲基化与青海地区胃腺癌发生的相关程度。方法收集青海大学附属医院经胃镜及病理首次确诊的28例胃腺癌住院患者为研究对象,采用亚硫酸氢盐测序(BSP)检测各样本TGFβI基因甲基化状态,比较癌组织和癌旁组织的甲基化状态差异。结果﹑胃腺癌组织甲基化克隆个数为478个,其甲基化率为11.42%;癌旁组织甲基化克隆个数为293个,其甲基化率为6.98%;胃腺癌组织甲基化程度高于与其相匹配的癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论青海地区患者胃腺癌组织甲基化状态显著高于与其相匹配的癌旁组织甲基化状态,说明青海地区胃腺癌高发可能与TGFβI基因启动子甲基化程度过高有关。

控制UPBI基因可让植物生长更快

美国杜克大学基因科学与政策研究所（IGSP）的研究人员称，用单个基因改造多年生牧草，可使其根部更加坚韧，生长更快，这有利于生物燃料的制造。

胰岛素样生长因子I基因第1内含子微卫星多态性对山西白猪体重和体尺性状的影响

试验检测了山西白猪174个个体胰岛素样生长因子～I（insulin～likegrowthfactorI，IGF～I）基因第1内含子以cA为核心重复序列的微卫星座位的多态性，并利用单变量动物模型分析了多态位点对山西白猪不同阶段体重和体尺性状的影响。结果表明，在该座位上，共检测到6个等位基因，分别为198、

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。

我国部分地方鸡种COⅠ基因多态性及其分子系统进化研究

以我国7个地方鸡种为研究对象,利用DNA测序技术测定线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cyto-chrome coxidaseⅠ,COⅠ)基因序列,分析地方鸡种COⅠ多态性及其分子系统进化关系。研究结果表明,选择的这段COⅠ基因序列有24个突变位点,为13个单倍型,其中11个单倍型为各品种所特有,可以作为各品种鉴定的依据;各鸡种在不同位点突变频率不同,7个鸡种均有其特异位点,根据这些特异位点,可以对其进行品种鉴定。7个品种间Kimura双参数遗传距离为0.001 81～0.008 48。7个品种的DNA分类和形态学分类基本一致,该基因可以用于探讨地方鸡种分类问题。

烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜内菌abaI基因表达的变化

目的了解烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜形成过程中，密度感应基因aba I表达变化及其对生物膜ECM和细菌耐药性的影响。 方法2011年1-10月，收集上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤住院患者创面、血液和静脉导管来源的鲍氏不动杆菌耐药菌6株、敏感菌5株。以鲍氏不动杆菌标准菌株ATCC 19606为参照。（1）临床分离株和标准菌株体外常规培养10、24、48 h后，经碘化丙啶染色，用激光扫描共聚焦显微镜观察生物膜厚度。（2）采用试管培养法，将临床分离株和标准菌株振摇培养10、24、48 h，培养液内漂浮细菌为游离菌，黏附于试管壁的生物膜内细菌为膜内菌。采用实时荧光定量PCR技术检测各菌株中aba I基因及pgaB基因的相对表达量（标准菌株基因表达丰度设为1）。对实验数据进行方差分析。 结果 （1）鲍氏不动杆菌临床分离株体外培养10、24、48 h，生物膜厚度均超过标准菌株，其中耐药菌株生物膜厚度分别为（28.8±0.6）、（ 31.7±1.1）、（38.1 ＋3.l）pLm，明显高于敏感菌株[（17.1±0.4）、（20.1±1.6）、（ 25.8±1.7） pLm，F值分别为1274. 38、206. 60，61. 73，P值均小于0.05]。（2）膜内菌：体外培养10、24、48 h，耐药菌株abaI表达量分别为6.6 ＋1.7、25.7±3.5、9.8＋3.6，均高于敏感菌株（2.7＋1．O、15．O＋3.5、4.7 ＋3.2，F值分别为21. 82、25. 24、6.22，P值均小于0.05）；耐药菌株pgaB的表达量分别为37.4±1.1、44.5±3.6、33.1 ＋11.5，明显高于敏感菌株（14.6 ＋0.8、20．O＋6.9、18.7 ＋6.8，F值分别为1488. 44、57. 26、6.01，P值均小于0.05）。（3）游离菌：体外培养10、24、48 h，耐药菌株aba I表达量均与敏感菌株接近（F值分别为0. 24、2.33、0.11，P值均大于0.05）；耐药菌株pgaB表达量分别为13.8±3.8、12.5±2.9、23.7±2.1，明显高于敏感菌株（7．O＋5.9、5．O＋1.3、15.6±6.7，F值分别为5.44、28. 42、7.76，P值均小于0. 05）。（4）膜内菌与游离菌的耐药菌株比较：膜内菌各时相点abaI表达量均多于游离菌（F值分别为43. 69、286. 61、9.98．P值均小于0.05），膜内菌pgaB表达量在10、24 h多于游离菌（F值分别为214. 26、283. 20，P值均小于0.05）。（5）膜内菌与游离菌的敏感菌株比较：膜内菌aba I表达量在培养24 h多于游离菌（F=70.28，P〈0.05），pgaB表达量在10、24 h多于游离菌（F值分别为8. 03、22. 62，P值均小于0.05）。 结论烧伤临床鲍氏不动杆菌分离株生物膜形成过程中，耐药菌株的密度感应基因aba I表达明显增多，可能引起pgaB基因表达上调，导致细菌ECM及生物膜形成增加、耐药性增强。

基于线粒体COI和Cytb基因序列的北太平洋柔鱼种群遗传结构研究

为准确掌握柔鱼的种群遗传结构,拟通过线粒体DNA的COI和Cytb基因序列分析方法对柔鱼不同产卵季节群体的遗传多样性和遗传结构进行研究。经PCR扩增与测序分别获得600 bp COI与481 bp Cytb基因序列。基于COI基因序列分析得到的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数及平均核苷酸差异数分别为24、(0.729±0.033)、(0.005 70±0.003 25)和3.421。基于Cytb基因序列分析得到的单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数及平均核苷酸差异数分别为28、(0.852±0.016)、(0.006 45±0.003 73)和3.101。分析认为,北太平洋柔鱼2个产卵季节群体均具有较高的单倍型多样性指数和较低的核苷酸多样性指数。单倍型邻接树、两两群体间的Fst值以及AMOVA分析结果均表明,北太平洋柔鱼2个产卵季节群体间的遗传差异不显著,不存在显著的群体遗传结构。初步认为,该海域因缺乏地理上的障碍,加之北太平洋海流的作用以及柔鱼个体较强的游泳能力,使得群体之间具有较强的基因流。