利用iCaspase9特异性诱导鸡原始生殖细胞消除的研究

【目的】制备在生殖细胞特异表达iCaspase9的鸡原始生殖细胞系(PGCs),提升外源性PGCs的生殖传递效率,为生产诱导不育的雄性或雌性受体鸡胚打下基础。【方法】利用piggyBac转座子将iCaspase9片段整合到鸡基因组中,构建稳定转染iCaspase9片段的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系,通过荧光微显镜观察鉴定其在iCaspase9系统诱导底物B/B二聚化配体作用下的细胞消除效果;再利用CRISPR/Cas9技术将iCaspase9片段定点插入DAZL基因第11外显子之后构建Dazl-iCaspase9-EGFP PGCs,经iCaspase9片段插入鉴定和PGCs生殖特性鉴定后,通过荧光微显镜观察鉴定其在B/B二聚化配体诱导下的消除效果。【结果】成功建立的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系与野生型DF-1细胞(WT DF-1)的生长增殖无显著差异(P>0.05,下同);CCK-8法测定发现,0.25~5.00 nmol/L B/B二聚化配体对WT DF-1细胞生长数量无显著影响,但CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞在添加B/B二聚化配体后,细胞数量较空白对照组极显著降低(P<0.01,下同),且失去正常的细胞形态,逐渐变圆甚至凋亡。成功建立的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs仍特异性高表达Cvh、Nanog、PouV、DAZL、Cdh和Ddx4等生殖细胞相关基因,在蛋白水平上也能鉴定出DAZL、SSEA1和CVH等蛋白,说明插入iCaspse9片段后并没有改变生PGCs的殖细胞特异性;在0.25 nmol/L B/B二聚化配体诱导作用下,DAZL-iCaspae9-EGFP PGCs数量显著减少,几乎全部消除,说明iCaspase9系统可诱导细胞凋亡而有效消除内源性PGCs。【结论】利用i Caspase9系统构建获得的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs在不改变其生殖细胞特性的同时,可在B/B二聚化配体诱导下有效消除内源性PGCs,为建立高效鸡种质资源恢复和基因编辑鸡制备等研究提供无内源性PGCs的受体鸡胚。