JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞iNOS的激活致多巴胺能神经元变性

目的探讨JAK2-STAT3途径与凝血酶诱导多巴胺能神经元变性作用的关系。方法20U/ml凝血酶或AG490(10μmol/L)预处理+凝血酶(20U/ml)处理原代培养的小胶质细胞或中脑腹侧混合培养体系,用Westernblot检测小胶质细胞P-JAK1、P-JAK2、JAK2、STAT3、P-STAT3的表达;免疫荧光观察多巴胺能神经元的变性;Westernblot、RT-PCR及激光共聚焦观察iNOS的表达。结果凝血酶处理小胶质细胞2h后诱导JAK2、STAT3的磷酸化,2h和4h分别增加小胶质细胞iNOS的转录和表达,并且24h诱导中脑培养体系多巴胺能神经元变性。而AG490预处理显著地减少对应凝血酶处理组小胶质细胞JAK2和STAT3的磷酸化,抑制iNOS的表达,并且缓解多巴胺能神经元的变性。结论JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞iNOS的激活,导致多巴胺能神经元变性。

环孢素A对大鼠急性脑缺血再灌注损伤小胶质细胞的活化及iNOS表达的影响

目的观察环孢素A(Cyclosporin,CSA)对大鼠脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞(microglia,MG)活化及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响,探讨其脑保护作用的可能机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、环孢素A组。改良线栓法制备建立局灶性脑缺血-再灌注动物模型,即大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,分别于手术后1d,3d,7d,14d免疫组化法观察大鼠海马一区OX-42及iNOS的表达情况,同时对大鼠神经行为学进行评分。结果模型组、环孢素组1d即有OX-42的大量表达,3d时OX-42达到高峰,14d时接近正常;iNOS 1d达峰,7d及14d时接近正常。环孢素组OX-42、iNOS较模型组减少(P<0.05),且神经行为学评分优于模型组(P<0.05)。结论小胶质细胞的激活及iNOS大量表达和脑缺血-再灌注损伤密切相关,环孢素A可显著减少脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞的激活和iN-OS的表达,对大鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

rAAV-AsiNOS抑制C6胶质瘤细胞生长的实验研究

目的探讨携带诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)反义RNA重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体(rAAV-AsiNOS)对胶质瘤细胞生长增殖的影响以及对iNOS和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等表达的影响。方法根据C6细胞培养基成分不同分为3组,即空白组[含10%胎牛血清的改良Eagle培养基(DMEM)培养液,n=4]、β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase gene z,lacz)重组腺相关病毒载体(rAAV-LacZ)组(含有rAAV-LacZ的10%胎牛血清的DMEM培养液,n=4)和rAAV-AsiNOS组(含有rAAV-AsiNOS的10%胎牛血清的DMEM培养液,n=4),C6细胞生长曲线;3组同时进行培养1、3、6、12、24 h,应用流式细胞仪(FCM)检测C6细胞中NT阳性细胞百分比、iNOS和VEGF阳性细胞百分比,应用半定量反转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)分析iNOS和VEGF mRNA表达。结果一定感染复数的重组病毒载体rAAV-LacZ对C6胶质瘤细胞生长趋势无明显影响,而rAAV-AsiNOS重组病毒载体在转染C6细胞从3d开始出现细胞生长缓慢,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测结果显示,NT、iNOS和VEGF阳性细胞在空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义(P>0.05),而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现NT、iNOS和VEGF阳性细胞百分比下降,NT百分比分别为9.37%±1.2%,97.3%±0.75%和4.62%±0.53%;iNOS百分比分别为18.42%±2.17%,14.29%±1.44%和8.31%±1.30%;VEGF百分比分别为7.85%±0.98%,6.32%±0.78%和5.04%±0.41%,较空白组之间差异均有统计学意义(P<0.05);半定量RT-PCR分析结果显示,同一时间中,iNOS mRNA在空白组和rAAV-LacZ组之间差异无统计学意义(P>0.05),而rAAV-iNOS组从培养6h开始出现iNOS mRNA表达下降,分别为0.46±0.04,0.34±0.03和0.21±0.03,较同一时间空白组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论携带iNOS反义RNA腺相关病毒载体rAAV-iNOS能够抑制C6胶质瘤细胞生长增殖,能够抑制iNOS表达,从而通过抑制VEGF基因表达发挥抗胶质瘤细胞生长增殖的重要作用。

吲哚美辛对大鼠C6胶质瘤细胞增生和iNOS酶活性的影响

目的探索吲哚美辛(IND)对大鼠C6胶质瘤细胞增生和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)酶活性的作用。方法用含5%FBS的高糖DMEM培养C6细胞,用无血清的DMEM培养24h后,加入终浓度分别为60、125、250μmol/L的IND作用24h,用MTT法检测细胞增生情况;细胞常规培养,用无血清的DMEM培养24h后,分别加入LPS、LPS加入30min后分别加60,125,250μmol/L的IND,作用24h后提取细胞培养上清液检测iNOS的酶活性。结果各浓度的IND使C6细胞增生明显降低,并显示出剂量依赖性;各浓度的IND能明显降低LPS诱导的iNOS的酶活性。结论IND强烈抑制C6细胞增生,并且显著抑制LPS诱导的C6细胞iNOS的酶活性。

多巴胺和乙酰胆碱抑制脂多糖刺激原代胶质细胞iNOS的表达

目的 观察多巴胺和乙酰胆碱对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激的原代胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)在转录和翻译水平上的影响。方法 培养原代胶质细胞,多巴胺和乙酰胆碱预处理30min后,加入LPS刺激12h和24h,分别采用RT PCR和细胞免疫组化来观察iNOS在转录和翻译水平的变化, 利用Griess方法测量了上清液中内源性生成的NO。结果 多巴胺能明显抑制iNOS的转录;乙酰胆碱在转录水平上对iNOS无影响,但二者在蛋白水平上都能够抑制iNOS的表达和NO的生成。结论 多巴胺和乙酰胆碱通过不同的方式抑制LPS刺激的原代胶质细胞iNOS的表达。

雌激素受体α免疫阳性星形胶质细胞在阿尔茨海默病病人海马中分布的改变

目的 :观察雌激素受体α(estrogenreceptorα,ERα)免疫阳性星形胶质细胞在阿尔茨海默病 (Alzheimerdisease,AD)病人组和老年对照组海马中的分布变化。 方法 :采用免疫荧光细胞化学双标方法和激光共聚焦扫描显微镜。结果 :ERα免疫阳性星形胶质细胞主要分布在齿状回的门和海马的分子层、放射层及始层。GFAP (glialfibrillaryacidicprotein)免疫阳性细胞、ERα胞核染色的和ERα胞质染色的星形胶质细胞 (number/mm2 )在AD组的CA1均显著增加 (P分别小于 0 .0 0 1,0 .0 5 ,0 .0 5 ) ,但其ERα核着色或质着色的星形胶质细胞占GFAP免疫阳性星形胶质细胞的百分数 ,在对照组 (2 .5 6 %,n =13;16 .6 8%,n =13)和AD病人组 (2 .15 %,n =13;2 6 .0 0 %,n=13)之间无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :这些结果表明 ,在AD的发病过程中雌激素可能通过ERα介导对海马星形胶质细胞的作用。

面神经离断伤后核团微环境中NG2阳性细胞及各类胶质细胞的反应

目的观察面神经离断伤后核团内NG2阳性细胞及各类胶质细胞的反应,探索面神经损伤后核团内胶质细胞微环境的变化。方法建立大鼠面神经离断伤模型,术后1、2、7、14、28d进行脑干及脊髓取材,采用免疫荧光双标、免疫组化结合Cresyl Violet染色观察面神经核团内胶质细胞及NG2阳性细胞的反应,Western blotting检测NG2蛋白表达的变化。结果面神经离断后,面神经核团内小胶质细胞逐渐对受损神经元形成紧密包绕,星形胶质细胞形成花环状簇拥,NG2蛋白呈现规律的时相性表达,NG2阳性细胞对受损神经元进行了广泛的"突触剥离"。结论各类胶质细胞参与了核团内胶质瘢痕的形成,NG2阳性细胞可隔离受损神经元,使其免于遭受兴奋性输入的潜在伤害。

孔圣枕中丹对SAMP8鼠海马CA1区PAS染色阳性颗粒状结构及星形胶质细胞纤维酸性蛋白的影响

目的研究孔圣枕中丹对SAMP8海马CA1区形态结构、PAS染色阳性颗粒状结构(PGS)及星形胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)的影响,探讨其改善SAMP8小鼠学习记忆的作用机制。方法选用7个月龄雄性的SAMP8小鼠分为模型组、治疗组;同时选用同源同月龄雄性的SAMR1小鼠作为正常老化对照组。检测指标:苏木精-伊红染色观察小鼠海马CA1区形态结构;免疫组化分析小鼠海马CA1区GFAP的表达;PAS病理特殊染色观察小鼠海马CA1区糖原的表达。结果孔圣枕中丹组海马CA1区神经元病理改变较模型组有明显改善;孔圣枕中丹PGS颗粒数有不同程度的减少,PGS颗粒体积减少,低密度颗粒数增加,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05);孔圣枕中丹组GFAP面密度与模型组、比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论孔圣枕中丹能通过对海马神经元组织结构的保护作用来提高SAMP8小鼠的认知功能。

泼尼松龙对脂多糖诱导的BV2细胞NO、iNOS及p38表达的影响

目的探讨泼尼松龙在脂多糖(LPS)所致小胶质细胞炎症反应中的作用。方法利用LPS诱导小胶质细胞株BV2,建立细胞炎症反应模型,实验细胞分为4组:空白对照组、LPS组、泼尼松龙组、LPS与泼尼松龙(0.1、1、10μmol/L)组。Greiss法测定细胞外液中一氧化氮(NO)含量;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测BV2细胞iNOS mRNA表达量;同时利用Western印迹技术检测BV2细胞iNOS和p-p38蛋白的表达量。结果 LPS能高度激活BV2细胞并且能使NO分泌增加,泼尼松龙呈剂量依赖性抑制NO含量;同时抑制iNOS、p-p38蛋白和iNOS mRNA表达。结论泼尼松龙能有效抑制LPS激活BV2细胞所分泌的NO,这种抑制作用可能是通过p-p38 MAPK位点下调p-p38、iNOS蛋白和mRNA的表达而发挥抗炎作用的。

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体合并抗N-甲基-D-天冬氨酸受体抗体阳性的单侧皮质脑炎1例

皮质脑炎是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗体相关疾病的一种重要临床表型,仅限于单侧的皮质脑炎是其特征性表现之一,而MOG抗体合并抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)抗体阳性介导的单侧皮质脑炎目前国内尚未见报道,现报道1例如下。1病例患者,男,20岁,因“发作性意识障碍、肢体抽搐1个月,加重伴发热、头痛20 d”于2021年4月16日急诊入住复旦大学附属华山医院。患者于2021年3月17日无明显诱因出现痫性发作.

海人酸、使君子酸致Huntington病鼠纹状体NOS阳性细胞的变化

为了研究海人酸和使君子酸对大鼠纹状体 NOS阳性细胞的影响 ,用神经毒海人酸、使君子酸破坏大鼠左侧尾壳核 ,将夜间活动超过 6 0 0次、主动回避试验阳性率在 35 %以下的大鼠作为成功的 Huntington舞蹈病模型。注射后 2个月 ,将动物脑切片进行 Nissl、NADPH-d组化和 GF AP免疫组化反应。结果表明 ,海人酸和使君子酸均可使纹状体 n NOS阳性神经元丢失、出现i NOS阳性胶质细胞和侧脑室扩大 ,两者无显著差异。在损伤中心区 n NOS阳性神经元减少甚至消失 ,但这种变化自中心向周围呈渐变趋势 ;i NOS阳性胶质细胞呈两种不同形态 :一类胞体略大而突起粗短 ,一类胞体小而突起相对较长。对侧纹状体及伤侧纹状体非损毁部均未见 NOS阳性胶质细胞 ;NADPH-d组化和 GFAP免疫组化双重反应表明一些 i NOS胶质细胞为 GFAP阳性胶质细胞。本研究提示 ,海人酸和使君子酸均可使纹状体 n NOS神经元减少消失 ,损毁区出现的 NOS阳性胶质细胞为诱导型神经胶质细胞 (i NOS)。海人酸和使君子酸所引起的

大鼠脑挫伤后GFAP和iNOS表达与损伤时间关系的实验研究

目的 观察大鼠实验性脑挫伤后胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)和诱导型—氧化氮合成酶 (iNOS)的表达及其时相性的关系 ,试图寻找法医学脑损伤时间的推断方法。方法 建立脑挫伤的动物模型 ,采用免疫组织化学技术 (SABC法 )观察大鼠脑挫伤后GFAP及iNOS在伤后不同时间的表达。染色结果用计算机彩色图像分析技术作定量统计分析处理。结果 ( 1)伤后 3h时GFAP阳性表达细胞开始增多 ,1d和 5d组单个阳性细胞染色强度达峰值 ,但在 3d组相对邻近组却下降 ,呈现出一双峰波形 ,7d达最大值 ;阳性物质总面积自 3h时表达增多开始后一直增加 ,直到 7d时达高峰。 ( 2 )伤后 12h组可见iNOS活性增高 ,并随伤后存活时间的延长 ,iNOS阳性细胞数目 (或阳性物质总面积 )逐渐增多 ,单个细胞染色强度逐渐加深。伤后 1d至 3d组阳性物质总面积达到高峰 ,5d后开始下降 ,但 7d时仍维持较高水平 ;而单个细胞染色强度随伤后存活时间的延长而加深 ,于 5d时达高峰后显著下降 ,但高于起始水平。结论 脑挫伤后GFAP和iNOS在损伤局部的染色变化有一定的时间规律性 ,可以用于脑挫伤的时间推断。

低渗刺激后大鼠视上核内星形胶质细胞和神经元的可塑性改变及其相互关系

为观察低渗刺激后大鼠视上核(SON)内星形胶质细胞和神经元的可塑性反应及其两者在反应时间和空间上的相互关系,我们采用大鼠尾静脉注射5.5 ml/kg低渗盐水(0.83%葡萄糖+0.3%NaCl)制作模型,应用抗Fos、抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)单标记,以及抗Fos/抗GFAP双标记、抗Fos/抗血管加压素(VP)/抗GFAP三标记的免疫组化方法.结果发现:在SON中GFAP阳性星形胶质细胞数量在刺激后15 min增加,其胞体肥大,突起伸长变粗,45 min达高峰.Fos阳性星形胶质细胞胞核呈蓝黑色小点,刺激后15～45 min达高峰,90 min明显减少;Fos阳性神经元胞核较大,刺激后15 min未见表达,45 min少量表达,90 min表达增加.该结果表明低渗刺激后,SON内星形胶质细胞的Fos表达早于神经元,三重标记显示星形胶质细胞与神经元关系密切,提示S0N内星形胶质细胞可能在低渗刺激的调节中发挥一定作用.

姜黄素衍生物对激活的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用

目的对比研究姜黄素(curcumin)及其衍生物对脂多糖(lipopolysacchar,LPS)激活的小胶质细胞一氧化氮(NO)的产生及诱导型一氧化氮合酶((inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响。方法用LPS(1μg.mL-1)刺激原代培养的大鼠小胶质细胞,同时用不同浓度姜黄素及其衍生物F进行干预,应用免疫组化方法观察细胞活性;Western-blot方法检测iNOS蛋白的表达;用Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric AssayKit检测细胞上清液中NO的含量。结果LPS作用4h后,iNOS蛋白表达明显增强,NO释放量明显增加;使用姜黄素干预18h后,浓度在5μg.mL-1以上时可以显著抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达和NO的产生,但是姜黄素衍生物只有在浓度达到25μg.mL-1时才对iNOS蛋白的表达和NO的产生有明显的抑制效果。结论姜黄素和它的衍生物都能够抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的产生,但其衍生物的作用相对较弱。

诱导型一氧化氮合酶在反应性及肿瘤性星形胶质细胞中的表达

目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、突变型p53及VEGF在反应性及肿瘤性星形胶质细胞中的表达及其在星形胶质细胞瘤发生发展、血管形成中的作用。方法:应用组织芯片及免疫组织化学技术检测12例正常脑组织、49例星形细胞反应性增生、49例低级别(I-II级)及50例高级别(III-IV级)星形胶质细胞瘤中iNOS、突变型p53、VEGF表达情况。结果:在正常脑组织中三者均为阴性表达;从星形细胞反应性增生组到高级别星形细胞瘤组,三者的阳性表达率均呈升高趋势,分别为:iNOS:28.89%(13/45),57.75%(27/47),81.63%(40/49);p53:23.81%(10/42),53.66%(22/41),79.55%(35/44);VEGF:22.73%(10/44),44.19%(19/43),69.77%(30/43),并且三者在星形细胞反应性增生组及低级别星形胶质细胞瘤组中的表达差异显著(P<0.05);各实验组中iNOS与p53表达水平一致性较好,具有明显的相关性(P<0.05);而iNOS与VEGF在低级别及高级别星形胶质细胞瘤组中表达水平具有较好的一致性及明显的相关性(P<0.05),在反应性增生组表达无相关性(P>0.05)。结论:iNOS、突变型p53及VEGF的过表达是胶质瘤发生的早期分子生物学事件,三者相互作用共同促进星形胶质细胞瘤的发生发展及血管的形成;单一或联合检测可能有助于星形细胞反应性增生及低级别星形细胞瘤的鉴别诊断。

脂多糖对大鼠大脑皮层星形胶质细胞分泌NO的影响

目的观察外源性内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于大鼠大脑皮层星形胶质细胞(astrocyte,AC)时,NO产生和释放的变化,以及选择性诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)抑制剂S-甲基异硫脲(S-methylisothiourea,SMT)对其的影响。方法运用Griess重氮化反应法检测NO代谢产物NO2-/NO3-来反映正常组、LPS(10μg/mL)诱导后及加入SMT(1μmol/mL)的LPS诱导后NO的活性。结果LPS作用后,AC合成和分泌NO增加,呈时间依赖性,且在24 h增加最明显;SMT能明显抑制LPS诱导AC的NO过分泌(P<0.001)。结论在体外培养的AC,LPS可诱导NO的合成和释放增加,该过程主要是通过激活iNOS表达实现的。

CD44s、CD44v6在颅内转移瘤与胶质母细胞瘤中的表达研究

目的:探讨粘附分子CD44基因蛋白在颅内转移瘤及胶质母细胞瘤中的表达及其与这些肿瘤侵袭、转移之间的关系。方法:应用标准型CD44(CD44s)和变异型CD44v6基因蛋白单克隆抗体,微波-LSAB免疫组化染色检测20例正常脑组织、35例脑胶质母细胞瘤和30例颅内转移瘤中CD44基因蛋白的表达情况。结果:20例正常脑组织中CD44s和CD44v6表达均为阴性;35例脑胶质母细胞瘤CD44s阳性表达率为100%(35/35),CD44v6表达为阴性;30例颅内转移瘤中CD44s阳性表达率为86.7%(26/30),CD44v6阳性表达率为66.7%(20/30)。CD44v6在颅内转移瘤及脑胶质母细胞瘤的表达差异有显著性(P<0.01)。结论:脑胶质母细胞瘤中CD44s的表达可能与其脑内侵袭过程有关,无CD44v6表达可能与其很少发生颅外转移有关,并有可能成为颅内转移瘤诊治的有用指标之一。

雷公藤多甙减少Aβ诱导的大鼠星形胶质细胞数

目的探讨雷公藤多甙对大鼠大脑皮质内注射β-淀粉样蛋白(Aβ)后星形胶质细胞的反应作用。方法采用GFAP免疫组织化学方法观察大脑皮质内注射凝聚态Aβ1-40后星形胶质细胞GFAP阳性细胞数。结果大脑皮质注射Aβ1-40后,GFAP阳性细胞数量明显增多,胞体截面积明显增大;给予雷公藤多甙治疗后,GFAP阳性细胞数量明显减少,胞体截面积明显减小。结论将凝聚态Aβ1-40注射入大鼠大脑皮质后可导致星形胶质细胞的激活,雷公藤多甙对Aβ诱导的星形胶质细胞的活化有抑制作用。