多样本人腮腺间充质干细胞诱导iPS细胞的对比研究

目的研究比较不同样本腮腺间充质干细胞(hPMSCs)生成诱导多潜能干细胞(iPSCs)的效果。方法分别分离培养3个患者的h PMSCs,应用游离质粒混合因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28、TP53 shRNA)电转导法重编程诱导获得iPS细胞(h PMSC-iPSCs)。比较在相同条件下3个不同供体来源腮腺细胞诱导iPS细胞的差异。结果 3个不同样本人腮腺间充质干细胞都成功诱导iPSCs,形成率分别为0.11%、0.10%、0.09%,无显著性差异(P>0.05);诱导形成iPS克隆时间有差异(P<0.05);形成iPSCs后维持培养倍增时间无差异(P>0.05)。结论不同患者可分离获得hPMSCs后成功诱导hPMSC-iPSCs,诱导效率无差异,诱导时间有差异。

牙源性间充质干细胞诱导iPS细胞的效率与时间的研究

目的研究比较不同种牙源性间充质干细胞诱导iPS细胞的效率与时间。方法分离牙髓干细胞(DPSCs)、脱落乳牙干细胞(SHED)、牙乳头干细胞(SCAP)。应用慢病毒介导Lin28、Nanog、Oct4和Sox2因子重编程获得iPS细胞。比较在同等条件下三种细胞获得iPS细胞的克隆数与平均诱导时间。结果DPSC诱导iPS细胞的效率是0.167%,高于SHED细胞和SCAP细胞的诱导效率(0.125%,0.033%);DPSC诱导iPS细胞的平均重编程时间是20.1d,均少于SHED细胞和SCAP细胞(23.73d,25.25d),差异均有统计学意义。结论三种不同牙源性细胞有不同的iPS细胞诱导效率与重编程时间,牙髓干细胞有较好的诱导iPS细胞的应用潜能。

一种改良的小鼠诱导多功能干细胞(iPS)向树突状细胞(DC)分化的方法

目的建立一种简便经济的小鼠诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)向树突状细胞(dendritic cell,DC)分化的方法。方法采用三段式培养法,将iPS细胞培养于op9细胞上,使用添加细胞因子GM-CSF(10 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)的培养液,经过17天的培养收集到iPS诱导的DC,通过显微镜及细胞涂片观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面分子,抗原吞噬实验和混合淋巴细胞培养实验等对其形态、表面分子及细胞功能进行检测及评估。结果本研究获得的iPS-DC在细胞形态上表现出明显的树突状特征;细胞表型上呈CD11b、CD11c双阳性;未经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的细胞呈未成熟DC的状态:细胞表面的第一信号分子MHCⅡ及第二信号分子CD40、CD80、CD86低表达,具有很强的抗原吞噬能力;经LPS刺激后细胞具有成熟DC的特征:MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表达均增高,同时具备对初始T细胞的激活能力。结论本研究改良了小鼠iPS细胞向DC分化的方法,缩短了培养时间,节省了培养成本。

诱导重编程过程中的表观遗传重塑

多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,具有广泛的临床应用前景.诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS cell)的获得,解决了传统方式中的细胞来源和伦理学等问题,从理论研究和应用上实现了体细胞重编程的重大突破,也为疾病发生机制研究、药物筛选、个性化药物选择、细胞治疗和再生医学等研究创造了难得的机会,从而开启了多能干细胞应用的新纪元.i PS过程中有很多问题尚未得到解决,尤其是诱导重编程的分子机制方面,这也是近年来干细胞领域研究的热点.其中如何实现表观遗传的重编程被认为是亟待解决的核心问题之一.本文结合我们的研究,主要介绍诱导重编程领域表观遗传修饰重塑机制的研究进展,并展望未来研究中大规模信息整合分析的重要性.

限定因子诱导胎猪成纤维细胞重编程为多能性细胞

尝试运用限定因子融合蛋白建立猪的诱导多能性干细胞.试验采用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种限定因子经慢病毒表达载体系统介导感染猪胎儿成纤维细胞,对表达外源限定因子的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代,逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,细胞集落生长状态稳定、核型正常、碱性磷酸酶检测为阳性,免疫细胞化学检测显示,Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性,体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤.结果证实分离培养的细胞克隆为猪诱导多能性干细胞,为进一步完善诱导方案和深入研究应用猪诱导多能性干细胞奠定了基础.

诱导性多潜能干细胞技术及应用研究进展

对诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的研究技术进展、临床应用前景以及存在问题等方面进行了综述。

利用诱导因子Oct4、Sox2和SV40T的mRNA介导体细胞重编程研究

为利用特定诱导因子Oct4、Sox2和SV40T的体外转录mRNA实现安全的成纤维细胞重编程,本研究成功构建了特定诱导因子Oct4、Sox2和SV40T的mRNA体外转录载体,并对体外转录mRNA进行了5′和3′端加工修饰;进行了诱导因子mRNA的293和IMR90细胞转染试验,利用免疫细胞化学、免疫荧光和Real-Time PCR分别检测了Oct4、Sox2、SV40T和Nanog的表达情况。结果显示,以上2种细胞以Oct4∶Sox2∶SV40T=2∶1∶1的mRNA比例转染后均表达这3种特定诱导因子,且相应蛋白都正确地定位在细胞核上。转染细胞中Oct4和Nanog的表达都特异性地增高。结果提示,3种诱导因子的体外转录mRNA能够在体内协同作用,激活细胞内源性干性标志基因Nanog的表达,为开启重编程过程奠定了坚实的基础。

甘草酸对骨髓间充质细胞诱导为多潜能干细胞重编程关键基因表达的影响

目的:观察甘草酸作用于骨髓间充质干细胞(BMSCs)后对成体细胞向诱导多潜能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPS)转化的关键基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog mRNA表达的影响,探索将BMSCs等成体细胞藉由中药提取物诱导为iPS的无病毒载体、无基因整合的方法。方法:培养BMSCs,分别加入6.25μmol/L、12.5μmol/L甘草酸,并设置空白对照组,培养15 d、30 d后检测Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4,Nanog mRNA的表达。结果:甘草酸6.25μmol/L培养15 d,能升高BMSCs细胞Nanog、c-Myc、Oct4、Sox2mRNA表达,且Nanog与正常组比较差异有统计学意义;培养30 d,Nanog、Sox2、c-Myc,虽与正常组比较差异均无统计学意义,但仍高于正常;甘草酸12.5μmol/L培养15 d对BMSCs Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Oct4 mRNA表达无明显影响,培养30 d可促进BM-SCs、c-Myc、Nanog mRNA的表达,与正常组比较差异有统计学意义。结论:甘草酸能增加对骨髓间充质细胞表达iPS诱导的关键性基因Nanog等的表达,而Nanog阳性的iPS细胞在基因表达谱上很难与胚胎干细胞区分出来,因此我们认为甘草酸可能对BMSCs向iPS转化具有促进作用。

诱导性多潜能干细胞研究进展

通过转染特定的一个或多个基因将已分化的体细胞诱导成为多潜能干细胞,这种干细胞称为诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS cells)。近年来关于iPS细胞的研究取得了举世瞩目的成就,多种已分化的体细胞都可以诱导成为iPS细胞,而且可以进一步将iPS细胞诱导成具有特定功能的细胞,称为诱导性细胞。这些研究极大地促进了细胞生物学、表观遗传学和发育生物学的研究,并且为人类再生医学和特异的细胞治疗带来了更美好的希望。对iPS细胞和诱导性细胞的最新研究状况进行了综述。

巴马香猪诱导多能干细胞系的建立

猪在农业和生物医学领域应用非常广泛,尤其是基因修饰的小型猪在器官移植和建立人类疾病模型中有重要的意义。然而,真正的猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)尚未建立,这极大地限制了转基因猪的产生。目前,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)技术是产生多功能干细胞的有效策略。虽然猪iPS cells建系已有数篇报道,但许多有价值的小型猪的iPS cells仍有待建系。利用可诱导基因表达慢病毒系统(Tet-on系统)在小型猪贵州巴马香猪骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)内过表达外源基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4,获得两株巴马香猪iPS细胞系(biPS4-1,biPS4-2)。获得的巴马香猪iPS cells与人ES cells(hES cells)形态相似;呈碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)阳性;表达干细胞特异的标志物SSEA4、Tra-1-81、Nanog、Rex1和CDH1等,但不表达SSEA1;核型检测正常。进一步的研究显示,它在体外和体内均能分化为外、中、内三胚层,具有多向分化的潜力。可诱导的巴马香猪iPS细胞的建立将为建立转基因猪提供便捷的工具,而基于该细胞系建立的转基因猪也有望服务于医学基础研究和器官移植等临床研究。

干细胞伦理之争的“终结者”——谈诺贝尔生理学与医学奖获得者山中伸弥

2012年诺贝尔生理学与医学奖得主日本学者山中伸弥在发现诱导多能干细胞(iPS)之前没有显赫的学术地位,但是他独特的思维方式,敢于挑战科学大问题的胆量,使他在最短时间内一跃成为生命领域的领跑者,开启了再生医学的全新篇章。探寻这位快速登上科学之巅的学者,回顾他的成长经历和伟大科学发现背后的故事,思维灵感会被点燃,创新之奥秘和乐趣也会渗透于心。

共表达外源OCT4/SOX2可激活人胚肾细胞中内源NANOG的表达

自2006年诱导多能干细胞(iPS)技术诞生以来,采用病毒等载体进行的诱导方法已取得了成功.但是,其致瘤性的影响限制了病毒载体的推广与应用,而采用非病毒载体诱导iPS细胞成为研究的热点.本研究通过2个启动子的独立启动,构建了带有绿色荧光标记的OCT 4/SOX 2共表达诱导载体(pOct4/Sox2-EGFP).将该载体转染HEK 293FT细胞后,阳性克隆明显表达绿色荧光.并通过RT-PCR、免疫荧光等方法证明其中的转录因子OCT 4和SOX 2能在转染细胞中高效表达,同时诱导受体细胞中内源NANOG的转录表达.本研究说明,OCT 4/SOX 2共表达载体能激活NANOG基因的内源表达,暗示着非病毒不整合载体pOct4/Sox2-EGFP本身或与其它转录因子和小分子结合可用于诱导成体细胞的重编程.因此,本研究为下一步应用质粒载体诱导体细胞重编程为iPS细胞的研究奠定了工作基础.

牛c-Myc/TAT/9R融合表达载体构建及其原核表达研究

原癌基因c-Myc虽然在许多肿瘤组织中特异性高表达,但它也是机体正常细胞生长与增殖所必需的因子,然而目前家畜诱导多潜能干细胞(iPS)研究中关于多功能转录因子cMyc的报道很少。为此,研究拟利用蛋白转导区域(PTD)的跨膜作用,构建TAT-bc-Myc-9R融合表达载体,并对其进行原核表达,旨在为转录因子蛋白重编程牛体细胞奠定基础。试验以牛c-Myc基因编码区序列为参考,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物,利用PCR等基因工程方法获得包括牛c-Myc、TAT和9R的重组原核表达载体(pTAT-HA-bcMyc-9R);酶切鉴定和DNA测序结果表明,试验成功获得bc-Myc-9R重组序列,成功构建重组质粒pTAT-bc-Myc-9R;不同IPTG浓度和诱导时间条件对该重组载体的诱导表达和SDSPAGE分析表明,TAT-bc-Myc-9R在0.6mmol/L IPTG和37℃诱导6h条件下表达约57KDa的目的蛋白。这些结果为PTD介导的转录因子蛋白直接重编程牛体细胞以获得iPS研究积累了科学资料。

诱导多能干细胞诱导体系研究现状及进展

体细胞诱导重编程为诱导多能干细胞是近年来干细胞研究领域一项新的技术,不仅为体细胞重编程去分化机制的研究注入了新的活力,而且为疾病发生发展相关机制研究及再生医学带来了新的曙光.诱导多能干细胞（iPS细胞）诱导体系作为该技术的核心部分,在转录因子的组成和导入方式、诱导效率及诱导安全性的提高等方面都有不断的进展.就近几年iPS细胞诱导体系的现状与应用前景进行综述和展望.

诱导多能干细胞的体细胞重编程方法与应用前景

体细胞重编程(somatic reprogramming)是指已分化的体细胞在特定条件下,其生长和发育的程序重新转变,成为另一型细胞,特别是恢复到全能性状态,逆转成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的过程。多能干细胞能在体内外分化成几乎所有类型的细胞,具有很高的理论研究价值。将已分化的人体细胞程序重排为多能状态可以产生对病人和疾病的特异性干细胞。本文介绍用转录因子的异位表达,介导产生诱导多能干细胞的方法和可能的危险性以及有较高安全性的"2A肽法"。目前,iPS技术还未进入临床应用,但已有一些有希望的尝试。

诱导多功能干细胞的影响因素

将体细胞诱导为多功能干细胞为人类的再生医学提供了一个全新的研究手段,从而可以不用损坏胚胎就能获得可用于治疗各种特殊疾病的细胞。本文比较了近年来关于生成诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)的诱导方法及重编程效率,总结了这些方法的共同点;另外通过对每个不同试验过程的影响因素进行比较,归纳了影响iPS细胞重编程过程的几个因素。

如何高效制备生殖系传递的嵌合体小鼠

目前,嵌合体技术已成为胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能性干细胞(iPS细胞)研究不可或缺的一部分,嵌合体小鼠模型主要用于基因功能、调控机制、致病机理等各方面的研究。要安全可靠地进行ES细胞和iPS细胞的各种应用性研究,首先需要验证细胞在体内向各种组织定向分化的能力,特别是生殖系传递的能力。而高效制备多能性干细胞生殖系传递的嵌合体小鼠,需要在分子水平、细胞水平、动物个体水平以及制备方法等各方面全面综合地分析考虑,才能达到实验设计的最优化。制备嵌合体小鼠主要有注射法和聚集法2种方法,各有利弊,在整个制备过程中,需要考虑不同发育阶段以及不同小鼠品系胚胎的分化潜能、选用远交系和杂交系的胚胎作为受体,同时要考虑ES细胞的遗传背景,选择低代次的远交系和杂交系的ES细胞或者iPS细胞,以及优选KSR培养体系。对于操作者,需根据实际情况,全方位地综合考虑,从而制定出合理的操作方案。

非编码RNA对干细胞命运的调控及其分子机制

干细胞研究的发展为人类重大疾病的治疗提供了新的途径和希望。已知多种调控因子影响干细胞的功能和应用,探讨干细胞增殖分化调控机理的基础理论研究将大大推进干细胞的临床应用。近年来,研究发现非编码RNA分子能够调控干细胞的功能。为此,2011年国家重大科学研究计划设立重大科学问题导向项目——非编码RNA对干细胞命运调控的机制研究。在该项目的资助下,项目组在非编码RNA对干细胞命运的调控机理研究方面取得一批原创性的研究成果。本文总结了项目组取得的突破性研究进展及存在的问题和未来的发展方向。

转SNanog-GFP绵羊成纤维细胞系的筛选

为了获得绵羊Nanog-GFP转基因细胞系,试验在已获得绵羊Nanog启动子带动GFP真核表达载体SNanog-p Ac GFP1-N1基础上,采用脂质体转染法将该载体导入绵羊的胚胎成纤维细胞中,在适当浓度的G418中筛选出转基因阳性细胞,观察其细胞形态以及生长曲线,通过PCR检测目的基因是否插入其基因组。结果表明:复苏前后的转基因阳性细胞的细胞形态呈成纤维细胞的长梭形,贴壁状态良好,其生长曲线为典型的S型,且PCR检测呈阳性。