iPSCs定向分化的内耳毛细胞与支持细胞间相互作用的研究

目的利用诱导多能性干细胞定向分化的内耳毛细胞和支持细胞探究这两种体外诱导分化细胞之间的相互作用。方法首先,利用细胞单层贴壁两步诱导法将三株i PS细胞(野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株)向内耳祖细胞及内耳毛细胞诱导分化,探究i PSCs定向分化内耳毛细胞的过程中是否有支持细胞的产生;其次,通过细胞免疫化学的方法探究体外分化的内耳毛细胞和支持细胞间的相互作用;最后,将表达绿色荧光蛋白(EGFP)的上皮样内耳祖细胞以圆窗膜穿刺的方法移植到白化荣昌猪的内耳中观察分析移植细胞在体内的迁移、分化以及在体内形成的联系。结果三株i PS细胞诱导分化为内耳毛细胞的过程中均有一部分细胞分化为支持细胞;对分化细胞进行E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的免疫荧光检测结果显示,E-cadherin、N-cadherin和ZO-1在支持细胞-支持细胞连接和支持细胞-毛细胞连接间都有表达;移植4周后,耳蜗免疫组织化学结果显示,三株不同来源的移植细胞均有少量细胞成功迁移到了毛细胞受损部位—柯底氏器,并表达毛细胞标志性蛋白MYO7A。移植细胞之间以及移植细胞与宿主细胞之间有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表达。结论 i PSCs诱导分化的内耳毛细胞和支持细胞在体内、外均能形成钙粘连接和紧密连接。这些研究结果对毛细胞取代法治疗耳聋策略的完善与发展有一定的科学意义。

人iPSC源性肝细胞抗体药物肝毒性评价研究

目的 用人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)源性肝细胞评估抗体药物的肝细胞毒性。方法 qPCR、Western blot、细胞免疫荧光检测肝细胞特征性表型分子白蛋白、尿素氮及药物代谢酶的表达;MTT法检测肝细胞生长情况;ELISA检测肝细胞白蛋白、尿素氮分泌水平;过碘酸-雪夫染色、油红O染色检测肝细胞储存糖原、脂滴的能力。结果 HcHAb18、Hab18、5A12单抗处理后人iPSC源性肝细胞生长和分泌功能并未发生明显改变;然而,肝细胞特征性表型分子表达降低,糖原和脂滴储存能力抑制,药物代谢酶表达相应改变。结论 3株单抗虽不影响人iPSC源性肝细胞的生存,但改变其表型和代谢;人iPSC源性肝细胞可用于抗体药物的肝细胞毒性评估。

绵羊iPS细胞诱导及转录组学分析

【目的】建立绵羊(Ovis aries)诱导性多能干细胞系,为绵羊转基因育种、应用绵羊诱导性多能干细胞奠定基础。【方法】利用电转将OCT4、SOX2、KLF4、l-Myc、Lin28转染至绵羊成纤维细胞中并诱导培养至有光滑隆起、边缘整齐的细胞克隆,形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光染色以及实时荧光定量PCR检测克隆细胞的生物学特性;利用高通量测序技术对诱导0、10、20、30 d的阳性细胞的差异表达基因进行筛选。【结果】克隆细胞中SOX2、OCT4、SSEA-1蛋白免疫荧光染色均呈阳性; OCT4、SOX2、Nanog基因表达量均极显著高于成纤维细胞;0和30 d转录组测序表明,被注释到GO数据库的差异表达基因有9 465个,其中,上调基因6 987个,下调基因2 478个;KEGG分析共有5 773个基因注释到259个通路中,其中,P53信号通路显著富集,且其在干细胞增殖方面起着非常重要的作用。【结论】初步成功建立了绵羊诱导性多能干细胞。

猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用

【目的】克隆猪L-Myc基因,并在蛋白水平表达的情况下探索其在细胞重编程中的作用,为深入研究猪L-Myc基因替代c-Myc诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)奠定基础。【方法】先通过NCBI序列比对,采用RT-PCR克隆猪L-Myc基因cDNA,生物信息学分析猪L-Myc基因与人和小鼠的同源性,构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1,通过载体转染和免疫印记检测猪L-Myc基因cDNA的蛋白水平表达;再将L-Myc基因装入逆转录病毒载体中,分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblast,PEF),通过形态变化和碱性磷酸酶(AP)染色验证猪L-Myc基因在细胞重编程中的作用。【结果】①获得了1 113 bp的猪L-Myc基因cDNA,编码364个氨基酸,理论分子质量为40 kD;②生物信息学分析显示猪L-Myc基因与人和小鼠高度同源;③免疫印记检测结果说明猪L-Myc基因cDNA能够在蛋白水平表达;④细胞诱导试验和AP染色结果显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc(OSKL)组合诱导的细胞阳性克隆率明显高于Oct4、Sox2和Klf4(OSK)组合的阳性克隆率。【结论】获得了猪L-Myc基因,并且该基因在蛋白水平表达且在细胞重编程过程中起到了重要的作用。

iPSCs在家畜育种中的作用研究进展

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)是一种具有多向分化潜能的多能性干细胞。大动物具有繁殖率低、世代间隔长等缺陷,利用ESCs进行扩繁、育种具有绝佳优势。但经过40年的探索,几乎所有大动物的ESCs尚未建立。2006年Yamanaka提出诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)制备方法,为大动物干细胞制备打开一扇新大门。获得iPSCs可以成功避开ESCs建系困难、胚胎来源有限、移植后发生免疫排斥等一系列严重限制干细胞育种应用的问题,在大动物育种中有非常重要和深远的应用前景。本文综述了iPSCs在大动物育种中的研究进展,深入探讨了iPSCs作为干细胞在大动物育种中的潜在应用价值,并展望其应用前景。

绵羊胚胎成纤维细胞饲养层用于培养人诱导性多能干细胞的效果研究

试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblast,SEF),经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照,人iPSC(hiPSC)为培养对象,通过形态学观察、碱性磷酸酶(AP)染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测,比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明,在试验期内,与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似,SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长,增殖速度快;AP染色呈蓝紫色,能够维持未分化状态;能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT 4和SOX 2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异(P>0.05)。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞,为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。

人诱导多能干细胞分化为心肌细胞关键基因的生物信息学分析

利用生物信息学分析的方法筛选人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)向心肌细胞分化的关键基因。收集GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中关于人i PSCs向心肌细胞分化的高通量测序数据,包含i PSCs向心肌细胞分化的4个阶段的样本数据,分别是未分化的i PSCs(D0)、中胚层细胞(D2)、早期心肌细胞(D7)和心肌细胞(D14)。应用R包分析D0、D2、D7和D14样品之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行功能和信号通路分析;构建差异表达基因的蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络;应用R包加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)对共表达的基因进行聚类,并将其划分为不同的基因模块;使用Cytoscape软件对重要基因模块的互作网络进行可视化和富集分析。结果显示,D0、D2、D7和D14样品之间的差异表达基因总共达917个,基于PPI网络筛选到的前10个基因分别是FPR2、ADCY2、CXCR2、CXCR4、PF4、GALR1、GAL、CXCL5、CXCL6和HCAR3,其中FPR2、CXCR2、CXCR4、PF4都富集G蛋白偶联受体配体结合的通路。基因相互作用关系分析显示,BMP5处于调控心肌发育的核心地位。研究基于表达谱GSE137920数据的生物信息学分析,筛选到人i PSCs向心肌细胞分化的关键基因,这将有助于心肌分化发育分子机制的深入研究。

探究与思维 梳理与推敲——2018年北京高考生物学第29题解读

科学探究与科学思维这两大学科素养在2018年北京高考生物学第29题中得到了很好的诠释。本文对该题进行了深入分析,为高考备考和试题命制提供借鉴。

畜禽遗传资源保护方法的研究进展

畜禽遗传资源作为生物多样性的重要组成部分,正面临着严峻的考验,对其开展保护工作是一项迫在眉睫更是必须持之以恒的任务。作者对目前畜禽遗传资源保护的主要方法和技术,包括活体保护及利用冷冻技术、基因文库技术、体细胞克隆技术和分子遗传标记等技术保护,特别是对近年新发展起来的诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)技术在畜禽遗传资源保护方面的应用作了概述,以期进一步对畜禽遗传资源保护奠定基础。

病人特异性iPSC源性心肌细胞在长QT综合征发病机制中的研究进展

诱导多能干细胞(iPSC)源性心肌细胞为疾病特异性和个体特异性心血管疾病的发病机制研究提供了新的方法和思路。本文简介了iPSC的生成和iPSC源性心肌的分化技术,以及病人特异性iPSC源性心肌细胞模型在长QT综合征(long-QT syndrome,LQTS)发病机制研究中的进展。

胰岛类器官基础应用的研究现状与展望

类器官指利用干细胞的全能性,将其在体外进行培养,使其不断进行自我更新和自我组织,形成结构和功能与原始器官相似的组织。类器官具有与原始组织保持相似外观和功能的特点,已广泛应用于基础研究及临床研究。目前已经成功培养出肝、肾、胰、脑、肠等类器官,其中使用胰岛类器官是类器官领域研究的热点,但由于还未完全解决移植术后排斥反应等问题,目前胰岛类器官仅用于基础研究。本文对胰岛类器官的起源与发展、胰岛类器官的基础应用进行综述,旨在为胰岛类器官实现基础应用向临床应用转化及糖尿病的治疗提供参考。

诱导性多能干细胞免疫原性的发生机制与干预对策

诱导性多能干细胞(iPSC)技术为再生医学开辟了一条广阔而富有前景的新途径。但近期对于自体来源的iPSC及其分化细胞免疫原性的研究结果存在争议,因此研究影响iPSC免疫原性的因素、机体对其可能的免疫排斥及相关免疫耐受机制是未来实现iPSC成功临床应用的重要基础课题。该文将就诱导性多能干细胞的免疫原性相关研究进展作一综述。

干细胞诱导分化为生殖细胞的研究进展

干细胞具有多系谱分化的可塑性,是再生医学的研究热点。通过各种调控、诱导手段从干细胞获得生殖细胞,为生殖细胞发生与发育障碍导致的不孕不育患者带来希望。本文将探讨从各种干细胞[胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)、精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)和卵巢干细胞(ovarian stem cells,OSCs)]获得生殖系细胞的研究进展并提出其临床应用前景与挑战。

iPSC在心脏钠离子通道疾病发病机制中的研究进展

诱导多能干细胞(iPSC)为疾病个体特异性发病机制的研究提供了新的模型及思路。本文简介了iPSC的制备和iPSC源性心肌细胞的分化技术,以及病人特异性iPSC源性心肌细胞模型在SCN5A基因突变引起的心脏钠离子通道疾病的发病机制研究中的进展。

外周血细胞重编程为诱导性多潜能干细胞的研究进展

诱导性多潜能干细胞(iPSCs)是指分化细胞中导入特定转录因子后逆转恢复到类似胚胎干细胞的具有自我更新、多向分化等潜能的一类细胞。诱导疾病特异性iPSCs是疾病机理、再生医学等领域的研究热点。目前,人iPSCs供体细胞主要来源于皮肤成纤维细胞,需要组织活检、体外增殖等繁琐过程。利用外周血细胞(peripheral blood cells)成功诱导iPSCs,具有取材方便、诱导快速等优点,将极大地促进iPSCs研究。该文在介绍iPSCs诱导方法的基础上,重点阐述了从小鼠B细胞、T细胞,人脐带血细胞,到人外周血细胞重编程为iPSCs的研究进展,分析了该技术的特点和可能存在的问题,并进行了前景展望。

三种干细胞向雌性生殖细胞诱导的可行性探讨

雌性生殖细胞缺乏所致的不孕症目前尚无根本的治疗方法,干细胞的研究为这类患者带来了希望。随着胚胎干细胞(ESCs)/诱导性多能干细胞(iPSCs)建系技术的日趋成熟,体外诱导ESCs/iPSCs生成雌性生殖细胞的研究也取得了一定进展,目前已经有卵母细胞样细胞的形成,但所生成细胞的生殖生物学功能还有待进一步证实。近年来雌性生殖干细胞的发现及对其进一步的了解使获取更接近生理状态的卵子成为可能。本文对近年几种干细胞及其在生殖领域的研究进行综述,以探讨其临床应用的可行性。

载体介导无遗传物质整合的诱导性多能干细胞的生成

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)因其具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的"自我更新"和分化潜能而成为生物学和医学等领域的研究热点之一。但是,目前i PSCs的生成主要以逆转录病毒或慢病毒为载体,而病毒载体和外源性重编程因子在受体细胞基因组中的整合,使得i PSCs存在致瘤性的安全隐患。同时,采用无载体介导的方法如重组蛋白、小分子物质的重编程效率较低。为此,目前已成功开发一些载体和方法可以介导无外源性遗传物质整合的i PSCs的生成。该文就整合后可删除的基因表达载体(Cre/lox P重组系统、piggy Bac转座子/转座酶系统)和非整合基因表达载体(ori P/EBNA1附加型载体、微环DNA载体)在i PSCs生成上的应用研究作一综述,以期为i PSCs的临床安全应用提供理论和技术参考。

癌细胞重编程：研究方法、应用及意义

癌,作为一种恶性重大疾病,由于其越来越高的发病率及致死性,已经引起了全社会高度的关注及重视.科研人员对癌相关疾病的研究也越来越广泛和深入.然而,由于癌症发生发展的复杂性,要想彻底了解癌的发生机制及研究出有效的治疗方法,还具有很大挑战性.近些年,随着细胞重编程技术的发展,不仅正常的细胞可以被重编程为多潜能状态,甚至癌细胞也能发生命运的逆转.越来越多的研究表明,致癌转变与重编程有着许多相似之处.因此对癌细胞进行重编程将成为探究癌症发生发展机制及治疗的一种独特的方法和思路.本文将从重编程的角度,综述有关癌细胞重编程研究的方法、应用及意义.