基于iTRAQ多重标记串联质谱技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异分析

目的 观察串联质谱技术在乳腺癌血清蛋白表达中的差异。方法 选取2020年2月~2021年2月黑龙江省牡丹江医学院附属二院收治的乳腺癌新辅助化疗患者20例作为研究组,包含10例化疗有效患者及10例化疗无效患者,同时选取8名健康者作为对照组。采集所有患者的肘静脉血,分别采用高通量miRNA、iTRAQ表达谱测序技术,从“组学”的角度对乳腺癌新辅助化疗不同疗效患者miRNA差异表达谱、外周血单个核细胞蛋白组进行研究。随后,先进行Pathway通路分析,该过程在蛋白质层面进行,然后找出sRNA的成熟体序列,在此过程中严格根据miRbase18数据库。将已知的cDNA序列整理为一行,对得到的sRNA对应靶基因进行预测,Pathway分析靶基因,最后将同一Pathway通路中的sRNA靶基因及蛋白质寻找出来。结果 研究组和对照组共筛选出19个差异表达蛋白,选取其中具有较大表达差异的肝细胞生长因子(HGF)进行验证。iTRAQ标记图谱显示,研究组和对照组的血清HGF表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。研究组Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表达水平逐渐升高(P<0.05),均高于对照组(均P<0.05),符合i TRAQ标记图谱鉴定结果。结论 串联质谱技术用于筛选发现乳腺癌细胞HGF表达水平升高具有显著效果,可有效指导临床诊治乳腺癌的工作,将有效参考提供给靶向治疗药物的开发。

基于iTRAQ技术对低级别胶质瘤与正常脑组织差异性表达蛋白的初步筛选研究

目的应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质。方法将6例低级别胶质瘤实体组织标本与2例正常脑组织标本各自混合后提取总蛋白,进行定量分析和酶解。iTRAQ标记后进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。通过Mascot2.9软件进行相关图谱分析。结果有效鉴定出低级别胶质瘤与正常脑组织差异表达蛋白质162个,其中34个上调蛋白质,128个下调蛋白质,这些差异表达蛋白质具有多种生物学活性,参与不同的代谢以及信号通路。结论通过iTRAQ技术可有效鉴定出众多低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质,为后续寻找低级别胶质瘤的生物标记物奠定基础。

iTRAQ技术及其在蛋白质组学中的应用

近年来随着蛋白质组学的迅速发展,其相应的方法学研究也取得了巨大的进步,一系列新技术融入了蛋白质组学研究中,极大地促进了这门学科的发展.相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术与高度敏感性和准确性的串联质谱及多维液相色谱联用技术已成为蛋白质定性和定量研究的主要工具之一.该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性.由于其能够同时对多达8种样品进行标记分析,故在生命科学的各个领域得到了广泛的应用.本文对iTRAQ的原理、实验流程、优缺点及近几年的应用进展进行综述.

基于iTRAQ技术的血清蛋白质组学研究进展

随着分子生物学的快速发展,血清蛋白质组学成为研究的热点。相对和绝对定量同位素标记(i TRAQ)技术没有出现之前大部分研究主要在双向凝胶电泳技术的支持下完成,但是该技术具有费时、费力、重复性差等缺点,不能完全避免和消除,人们就注入了新的研究方法—i TRAQ技术,该技术具有灵敏度高、分辨率高、重复性好、易自动化和检测范围广等诸多优点,使该技术在医学和生物制药领域受到高度关注和广泛应用。该文就最近几年基于i TRAQ技术的血清蛋白质组学研究进展、标志物的探索等相关问题进行综述。

化学衍生辅助液相色谱-串联质谱测定枇杷膏中的齐墩果酸和熊果酸

建立了一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时测定齐墩果酸和熊果酸含量的分析方法,利用衍生化试剂N,N-二甲基乙二胺(DMED)和d4-N,N-二甲基乙二胺(d4-DMED)分别衍生样品和标准工作溶液中的目标分析物,并将标准工作液的衍生产物作为稳定同位素内标。该方法线性关系良好,相关系数均>0.99;齐墩果酸和熊果酸的检出限(S/N=3)分别为0.92 ng/L和1.06 ng/L,加标回收率分别为98.7%~102.7%和97.2%~105.0%。该方法简单、快速、准确,可满足枇杷膏中齐墩果酸和熊果酸高灵敏度检测的需求。

iTRAQ技术及其在动物蛋白质组学中的研究进展

同位素的相对与绝对定量(iTRAQ)是一种全新且功能强大的蛋白质组学定量分析技术,该技术具有灵敏性高、重复性好、分析范围广和高通量等优点,其与多维液相色谱和串联质谱相结合,已经成为蛋白质组学定量研究的主要手段之一。近年来,iTRAQ技术在不断优化的同时,也已经在动植物、微生物等领域,以及在寻找蛋白质标记物、多时间点蛋白动态监测等方面被广泛应用。文章介绍了i TRAQ技术的基本原理、流程,并对i TRAQ技术在畜禽及模式动物蛋白质组学领域的研究进展进行了综述。

iTRAQ定量蛋白质组分析中多级质谱采集策略对比分析

目的比较二级和三级质谱两种碎裂模式对基于同位素标记定量的蛋白质组学技术准确度的影响。方法采集斑马鱼在氧气浓度5%条件下,0,24,48 h取样斑马鱼脑组织蛋白样品,提取蛋白质进行i TRAQ标记,高p H值反相柱分离成15个组分,分别采用纳升液相色谱分离肽段,串级质谱(MS2)或三级质谱(MS3)两种方法碎裂肽段,利用MaxQuant定量蛋白质组分析软件,获得报告离子强度信息。结果 MS2碎裂和MS3碎裂分别鉴定到7 624个和6 940个蛋白质;MS3碎裂获得的差异蛋白质数量明显多于MS2,分别为173和641个,相同的蛋白质,MS3的差异比值距离1∶1的距离更远。虽然MS3鉴定的谱图数较低,但鉴定到的肽段和蛋白质数目降低不明显。结论对基于i TRAQ标记的定量蛋白质组研究策略,MS3质谱分析提供更为显著的差异分析结果,是更优的选择。

生物技术及产品——Pronota公司推出生物标记物平台

比利时Pronota公司已推出其生物标记物验证平台MASSterclass。公司称，这一无抗体系统可减少用于筛选血液中低丰度生物标记物的大量蛋白分析开发的费用和时间。该技术采用了一系列与靶向串联质谱相结合的新的正交复杂性减低步骤（orthogonal complexity reduction）。这一新平台是Pronota公司的生物标记物发现平台的补充，后者可产生一张血液中低丰度蛋白生物标记物的列表。

磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用

磷酸化修饰蛋白质的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对于目前磷酸化蛋白质分析所涉及的各种方法,包括放射性同位素标记,抗体免疫印记等传统方法和以串联质谱各种扫描技术为基础,结合亲和提取、液相色谱质谱联用等手段的新技术、新方法,以及这些技术在磷酸化蛋白质组学中的应用予以评述。

蛋白质组学研究中的新技术

随着后基因组时代的到来,蛋白质组研究日益受到密切关注。蛋白质组学的发展需要有先进的技术平台作支撑。除了蛋白质组研究中的三大核心技术-双向电泳、质谱和生物信息学技术,近几年又不断涌现出许多新技术。本文对同位素标记亲和标签、酵母双杂交、多维色谱—质谱联用等新技术作一概述。

多头带绦虫成虫和幼虫的iTRAQ蛋白质组学分析

目的分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和液相串联质谱(LC-MS/MS)分析,当两种样品蛋白的差异倍数达到1.5倍以上,且经检验有统计学意义时,视为差异蛋白。结果本研究共鉴定了684个蛋白,其中130个差异表达蛋白,相对于幼虫,成虫上调蛋白69个,分别为副肌球蛋白,果糖-1,6-二磷酸酶,钙结合蛋白,六钩蚴蛋白Tso22c,热休克蛋白70,8 kDa糖蛋白,肌球蛋白轻链,钙调蛋白等;成虫下调蛋白61个,分别是抗原cC1,钙蛋白酶,膜联蛋白B3,皮层蛋白,糖脂转移蛋白,微管相关蛋白,乳酸脱氢酶B,xpa-结合蛋白等。通过实时定量PCR验证了10个差异明显的蛋白。另外,差异蛋白路径注释中约30%的蛋白参与了代谢途径和次生代谢物的生物合成。结论本研究为多头带绦虫发育、生活史及寄生虫-宿主的互作机制研究提供了基线资料。

辽宁汉族人群6个短串联重复序列基因座的遗传多态性

利用多重PCR和4色荧光(5-FAM,JOE,NED和ROX)自动化检测技术调查辽宁地区汉族人群CSF1PO,THO1,D16S539,2S1338,D19S433和TPOX等6个STR基因座多态性分布并计算该6个基因座的基因频率(Pi)、个体识别率(DP)、无偏倚期望杂合度(H)、多态性信息含量(PIC)和非父排除率(PE).结果显示,6个STR基因座的基因型分布符合HardyWeinberg定律.6个STR基因座累积个体识别率(CDP)为0.99999948,累积非父排除率(CPE)为0.98927.6个STR基因座适合作为中国人群的遗传标记,用于人类学、遗传疾病基因连锁分析、法医学亲子鉴定和个体识别等研究领域.

iTRAQ结合2DLC-MS/MS技术筛选前列腺癌差异表达蛋白

目的应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)结合二维液相色谱-串联质谱技术(2DLC-MS/MS)筛选前列腺癌差异表达蛋白。方法将前列腺穿刺活检的组织标本分为三组:良性前列腺增生组(20例)、前列腺癌组(20例)以及前列腺上皮内瘤组(10例)。对这些组织标本进行蛋白提取、定量和酶解。iTRAQ标记后(其中114标记良性前列腺增生组,116标记前列腺癌组,117标记前列腺上皮内瘤组),进行2DLC-MS/MS分析。利用ProteinPilot软件(版本3.0)对MS/MS肽段进行分析,在International Swissprot(090210,human)数据库中搜寻蛋白并定量。差异表达蛋白界值设定:大于1.5倍或小于0.66倍且P<0.05认为二者之间存在显著差异表达。Western-blot进一步验证了TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu、Decorin的表达。结果总共鉴定出760种蛋白。相对于良性前列腺增生,前列腺癌差异表达蛋白共有46个,其中有20个蛋白明显上调,26个蛋白明显下调。Western-blot的验证结果与这些蛋白的表达变化相符合。结论通过iTRAQ技术分析得到的前列腺癌差异表达蛋白可靠,iTRAQ技术为筛选出有意义的前列腺癌生物标记物提供了一个良好的平台。

基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱分析多态性遗传标记

随着人类基因组测序工作的完成,多态性遗传标记及其检测手段日益受到重视。基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱作为一种高通量的单核苷酸多态性分型技术受到关注,它不仅可以分析单核苷酸多态性,还可以进行微测序、分析短串联重复序列。目前的分析方法有:引物延伸法、连接酶反应法、肽核酸法、侵入法等。

基于相对和绝对定量同位素标记技术对肥胖大鼠海马区差异蛋白组学的研究

目的筛选及鉴定肥胖大鼠海马区的差异蛋白表达。方法将24只SD大鼠随机分为单纯肥胖组(Ob,n=14)及正常对照组(NC,n=10)。予高脂高糖饮食制备单纯肥胖大鼠模型,采用相对和绝对定量同位素标记技术(iTRAQ)联合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)法鉴定肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,对所获蛋白行生物信息学分析,Western blot法对筛选的部分差异蛋白进行验证。结果成功建立单纯肥胖大鼠模型,共鉴定出310种差异蛋白表达。于KEGG数据库检索筛选出26个差异蛋白显著富集的代谢通路。选取位于蛋白功能相互作用网络交叉点的4种差异蛋白行Western blot验证,发现蛋白表达水平与质谱结果一致。结论采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效筛选肥胖大鼠海马区差异蛋白表达,为研究肥胖对中枢神经系统损伤机制提供依据。

基于iTRAQ技术的糖尿病SD大鼠海马纹状体区差异蛋白组学研究

目的 筛选及鉴定糖尿病大鼠海马纹状体区的差异蛋白表达.方法 采用随机方法,将SD大鼠分糖尿病组(n=15)及正常组(n=10).采用高脂高糖饮食联合一次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备糖尿病大鼠模型,以糖尿病大鼠及正常SD大鼠海马纹状体区为研究对象,采用核素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)联合双向液相色谱-串联质谱(2DLC-MS/MS)鉴定糖尿病大鼠海马纹状体区差异表达蛋白,对所获蛋白行生物信息学分析,筛选其中几个候选蛋白,行Western印迹检测,验证这些蛋白在糖尿病大鼠海马纹状体区中的表达.结果 成功建立糖尿病模型,共鉴定出347种差异表达蛋白(其中上调蛋白139个,下调蛋白208个).包括与帕金森相关的铁蛋白代谢型谷氨酸受体2型,铁蛋白,亮氨酸重复序列蛋白及Complexin2蛋白等.KEEN检索提示多巴胺能神经突触路径,补体通路,缝隙连接,自噬路径及FcγR介导的吞噬作用等通路呈现显著的差异蛋白富集.蛋白质功能相互作用网状图发现铁蛋白(ferrin)、醛酸/酮还原酶(aldehyde/ketone reductases,ARK),钙结合蛋白(Ca2+-binding protein,CaBP),蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)等蛋白处于相互作用网络的交叉点.筛选上述4个蛋白后运用Western印迹验证,发现这4种蛋白表达水平与质谱结果一致(P<0.05).结论 采用iTRAQ结合2DLC-MS/MS技术,能有效地筛选糖尿病大鼠海马纹状体区差异蛋白的表达,为糖尿病对中枢神经系统损伤机制研究提供新线索,对神经退行性疾病的诊断及治疗提供新思路及潜在的治疗靶点.

大鼠股神经肌支和隐神经损伤前后差异蛋白分析

目的研究股神经肌支和隐神经纤维损伤7 d后二者蛋白表达的差异。方法成年雌性SD大鼠20只,体质量220~250 g。将大鼠右侧股神经干横断,左侧作为对照组不作处理。7 d后分别对正常股神经肌支及隐神经、损伤股神经肌支及隐神经取材,运用同位素标记相对和绝对定量技术标记(114标记正常的股神经肌支;115标记损伤的股神经肌支;116标记正常的隐神经;117标记损伤的隐神经)并结合二维液相色谱-串联质谱技术进行差异蛋白分析。结果共鉴定出3 358个蛋白。其中损伤的股神经肌支与正常的股神经肌支相比差异蛋白293个,表达升高112个,表达降低181个;损伤的隐神经神经与正常的隐神经相比差异蛋白417个,表达升高184个,表达降低233个。结论成功筛选出大鼠股神经运动神经纤维与感觉神经纤维损伤前后的差异蛋白,可为周围神经再生研究提供基础数据。

人常乳与牛常乳中全谱游离氨基酸和水解氨基酸的对比

以产后30～40 d的人常乳和牛常乳为原料,采用同位素标记相对和绝对定量结合高效液相色谱-串联质谱技术对人常乳和牛常乳中全谱游离氨基酸和水解氨基酸的种类及含量进行对比分析。结果表明,人常乳和牛常乳中游离氨基酸质量浓度分别为0.37 g/L和0.16 g/L,水解氨基酸质量浓度分别为2.5 g/L和3.3 g/L。在全谱游离氨基酸中,人常乳和牛常乳均检测到9种必需氨基酸以及15种非蛋白质编码氨基酸,分别检测到11种和7种非必需氨基酸,其中人常乳9种必需氨基酸、10种非必需氨基酸以及7种非蛋白质编码氨基酸质量浓度显著高于牛常乳(P<0.05);在全谱水解氨基酸中,人常乳和牛常乳均检测到8种必需氨基酸、10种非必需氨基酸以及12种非蛋白质编码氨基酸,其中人常乳γ-氨基丁酸、牛磺酸、α-氨基正丁酸和β-丙氨酸质量浓度显著高于牛常乳(P<0.05)。本研究对比分析人常乳与牛常乳中全谱游离氨基酸和水解氨基酸的种类和含量差异,为配方乳制品以及功能性食品的发展提供一定的参考。

SLE合并SONFH患者血清差异表达蛋白筛查

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)合并激素性股骨头坏死(SONFH)患者血清蛋白质组学表达差异,寻找并鉴定诊断SONFH的潜在生物学标志物。方法分别采集10例SLE合并SONFH患者(SONFH组)、5例健康者(对照组)的外周血,提取血清,去除高丰度血清蛋白质,采用同位素相对标记与绝对定量技术联合二维液相色谱-串联质谱技术进行蛋白组学分析,并进一步行GO和KEGG通路生物信息学分析,寻找并鉴定差异表达的蛋白质。结果与对照组比较,SONFH组共鉴定出16个差异表达蛋白,其中铜蓝蛋白、结合珠蛋白、IGHG1蛋白、免疫球蛋白重链1、C反应蛋白、补体C9、α1-酸性糖蛋白表达上调(P均<0.05),SERPINA4蛋白、凝溶胶蛋白、凝血因子Ⅻ、色素上皮细胞衍生因子、备解素、巯基氧化酶1、凝血因子ⅩⅢ、KRTDAP蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白3表达下调(P均<0.05)。KEGG通路分析提示以上16个蛋白与补体及凝血级联反应、系统性红斑狼疮、肌动蛋白细胞骨架调节、p53信号通路、卟啉和叶绿素代谢、FcγR-介导吞噬信号通路密切相关。结论成功从SLE合并SONFH患者血清筛选出差异表达蛋白,此16个蛋白可能是诊断SONFH的潜在生物学标志物。

大鼠感觉、运动神经瓦勒氏变性前后蛋白分析

目的通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术联合二维液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术研究感觉、运动神经损伤7 d后蛋白表达差异。方法成年雄性Wistar大鼠40只,体质量220~250 g,随机分为对照组和实验组,各20只。实验组大鼠脊髓横断,对照组不作处理。7 d后对两组大鼠脊神经前后根神经取材,运用iTRAQ技术标记(114标记正常运动神经;115标记损伤的运动神经;116标记正常的感觉神经;117标记代表损伤的感觉神经)并结合2D LC-MS/MS技术进行差异蛋白分析,并利用基因本体论和京都基因与基因组百科全书信号通路分析差异蛋白所在信号通路。结果共鉴定出4 312个蛋白:1)其中运动神经损伤后差异蛋白数量为637个,表达升高的有265个,表达降低的有372个;2)感觉神经损伤后差异蛋白数量为626个,表达升高的有258个,表达降低的有368个。结论成功筛选出大鼠运动神经与感觉神经损伤前后的差异蛋白,可为周围神经再生研究提供支持。