定量蛋白质组学技术在口腔鳞细胞癌中的应用进展

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,已经逐渐成为全球性的公共卫生问题,预防及早期诊断是减轻其负担的主要目标。定量蛋白质组学技术可用于定量细胞、组织或生物体的总体蛋白质含量,近年来被用于探索OSCC特异性的生物学标志物,研究其发病机制,寻找特异性治疗靶点等,为OSCC的早期诊断及治疗提供新思路。

基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法研究进展

定量蛋白质组学已经成为后基因时代的重要研究方向之一。目前该领域的研究主要采用无标记定量方法和稳定同位素标记定量法。其中,基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法发展非常迅速,已为生命科学研究提供了重要的技术支撑。本文分析了基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法,包括相对定量方法和绝对定量方法,并对其发展进行了展望。

iTRAQ标记技术及其在微生物比较蛋白质组学中的研究进展

病原微生物的致病作用是由多种蛋白质共同参与下的病原微生物．宿主相互作用的复杂过程，因此应用比较蛋白质组学方法动态、整体和定量地分析病原微生物致病过程中蛋白质的差异表达谱，对于解析病原微生物的致病机制具有至关重要的作用。相对和绝对定量的等量异位标签技术（Osobafic tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）以其高通量、重复性好、能够处理复杂样本和同时进行定性、定量分析的优点，在生命科学各个领域中得到了广泛的应用。

基于稳定同位素标记和平行反应监测的蛋白质组学定量技术用于肝癌生物标志物的筛选和验证

肝癌是全球第五大恶性肿瘤,其五年生存率极低,及早地发现与诊断对肝癌的临床治疗具有重要意义。通过结合体外稳定同位素标记的蛋白质组学相对定量技术和基于平行反应监测的靶向蛋白质组学定量技术,建立了一种癌症生物标志物的筛选和验证方法。该方法被用于肝癌组织的差异蛋白质筛选和后期验证,共筛选到70个在癌组织中显著变化的蛋白质,并对其中7个蛋白质进行了验证。所验证的蛋白质包括已在临床使用的肝癌标志物甲胎蛋白(AFP)和文献报道的潜在肝癌生物标志物热休克蛋白(HSP90)、脂肪酸结合蛋白5(FABP5)和乙醇脱氢酶4(ADH4),说明了该方法的可靠性。该文所筛选的差异蛋白质可以为肝癌生物标志物研究和临床验证提供参考;该方法还可用于其他癌症样品的差异蛋白质筛选和验证。

应用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选无乳链球菌鱼源株与牛源株差异表达蛋白

为揭示不同宿主来源无乳链球菌致病机制,提取无乳链球菌鱼源株GD201008-001和牛源株ATCC13813的全菌蛋白质,经iTRAQ试剂标记后进行质谱鉴定,质谱数据用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行查库(UniProt数据库)鉴定及定量分析,并利用blast2go软件对差异蛋白质进行GO(gene ontology)功能注释。共鉴定出在鱼源株GD201008-001和牛源株ATCC13813中差异表达的蛋白质17个(P<0.05),其中在ATCC13813中上调表达的蛋白质3个(比值>1.500),下调表达的蛋白质14个(比值<0.667)。GO分析预测结果表明这些蛋白质主要参与15个生物学功能,涉及代谢过程、细胞成分、结合、催化活性、结构分子活性等。其中cpsIVK在牛源株ATC13813中下调最显著,其功能为荚膜生物合成蛋白质,与无乳链球菌荚膜合成相关。进一步验证发现,鱼源株GD201008-001抵抗小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬的能力显著高于cpsIVK下调的牛源株ATCC13813(P<0.01),提示cpsIVK可能在鱼源无乳链球菌逃避宿主免疫细胞吞噬过程中发挥功能。

应用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选无乳链球菌鱼源株与人源株差异表达蛋白

以斑马鱼和巨噬细胞作为体内、外感染模型,比较无乳链球菌鱼源株GD201008-001与人源株A909的致病性差异,利用iTRAQ技术和质谱分析技术进行差异表达蛋白鉴定,以期为揭示无乳链球菌不同宿主来源株致病机制提供新思路。实验通过测定菌株GD201008-001、A909的斑马鱼半数致死量和巨噬细胞吞噬率,比较二者致病性差异;提取全菌蛋白,经iTRAQ试剂标记后进行质谱鉴定,质谱数据用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4进行查库(Uni Prot数据库)鉴定及定量分析,并对差异蛋白进行GO功能注释和KEGG通路分析。结果显示,GD201008-001毒力显著高于A909;通过iTRAQ分析两株菌差异表达蛋白,发现差异蛋白涉及的生物学功能较为广泛,在鉴定出的368个差异表达蛋白中,GD201008-001中上调表达蛋白193个(比值>1.5),下调表达蛋白175个(比值<0.667)。生物信息学分析预测这些蛋白主要涉及26个生物学功能,14个通路,推测Clp X、Glm S和Cps IVK可能在两株菌致病性差异中发挥重要作用。本研究为阐明无乳链球菌不同宿主来源株致病性差异奠定了基础。

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件。在pH8.0的Na2B4O7/H3BO3缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全。对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点。结果表明:在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99,r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%。

定量蛋白质组学中的同位素标记技术

定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定,并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定,是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来,由于质谱技术和生物信息学的进步,定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就,但其最显著的成就应该归功于稳定同位素标记技术的应用。该技术使用针对某一类蛋白具有特异性的化学探针来标记目的蛋白质或肽段,同时化学探针要求含有用以精确定量的稳定同位素信号。在此基础上,实现了对表达的蛋白质差异和翻译后修饰的蛋白质差异进行精确定量分析。综述了在定量蛋白质组学中使用的各种同位素标记技术及其应用。

应用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选乳腺癌患者血清差异表达蛋白

目的筛选乳腺癌患者血清特异性表达蛋白,以寻找乳腺癌早期诊断的生物标志物。方法采集血清,提取蛋白,i TRAQ标记和ESI-QTOF-QⅡ质谱检测,再搜库和Scaffold软件分析,得到各组间血清差异表达蛋白。进一步采用Western blot验证差异蛋白。结果血清中共鉴定出335个蛋白,达到严格定量标准的蛋白151个;乳腺癌与对照组间共筛选出23个差异表达蛋白;乳腺癌与乳腺纤维瘤组间筛选出8个差异蛋白。Western blot验证Serotransferrin,Vitronectin,soform 1 of Gelsolin 3个蛋白在各组中的表达结果与i TRAQ检测结果一致。结论本研究证实i TRAQ-LC-MS/MS技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究,并筛选到多个与乳腺癌发病相关的血清蛋白,有可能作为乳腺癌早期诊断的生物标志。

等电聚焦分离与^18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。

牛支原体iTRAQ定量蛋白质组学分析

为了解牛肺炎支原体临床分离菌株(HN12)与标准菌株(PG45)蛋白质差异表达情况,采用定量蛋白质组学研究策略,在牛支原体临床分离菌株(HN12)和标准菌株(PG45)的全蛋白质中进行差异蛋白质鉴定,并进行生物信息学分析。结果表明,共鉴定2402个蛋白质,其中存在显著差异的有66个。上调蛋白质数量为25个,下调蛋白质数量为41个。鉴定出的蛋白质主要有膜蛋白、跨膜蛋白、脂蛋白、延长因子、膜脂蛋白P81、伴侣蛋白、可变表面脂蛋白和ABC转运蛋白等。

基于非标记定量技术的继发性肺结核患者血浆蛋白质组学研究

目的研究继发性肺结核患者特异蛋白标志物的血浆蛋白质组学,寻找继发性肺结核特异性蛋白标志物。方法应用非标记(label-free)定量蛋白质组学技术检测30例继发性肺结核患者(结核组)和30名健康对照者(对照组)血浆蛋白质谱,结核组某蛋白丰度较对照组差异倍数>2(上调)或<0.5(下调)及两组某蛋白丰度经t检验P<0.05的蛋白被认为是差异蛋白。应用基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)等分析软件对差异蛋白进行生物信息学分析。两组间蛋白平均丰度的差异分析采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果结核组与对照组比较共发现518个差异表达蛋白,其中有256个差异蛋白表达上调,262个差异蛋白表达下调。生物信息学分析发现差异蛋白的分子功能主要集中在结合(29.79%,406/1363)和蛋白质结合(24.80%,338/1363);参与生物学过程主要为参与细胞过程(14.75%,467/3167)和代谢过程(11.11%,352/3167);差异蛋白的细胞定位分析发现,大部分蛋白定位在细胞内(22.07%,389/1763)及细胞(22.01%,388/1763)。KEGG分析发现背腹轴形成通路及黏着斑形成通路等17个上调通路与1个下调通路在结核组与对照组间具有差异性。结论结核组患者的血浆蛋白发生了明显的改变,这为探索继发性肺结核发生发展的机制提供了有价值的线索。

iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选唐氏综合征孕母血清差异蛋白

目的筛选唐氏综合征(Down’s syndrome,DS)母体血清差异表达蛋白质,确定和验证DS相关的候选标志物。方法收集DS胎儿(实验组)和正常胎儿(对照组)母体血清各15例,组内等体积混合后采用免疫亲和柱去除高丰度蛋白。同位素标记的绝对和相对定量技术(i TRAQ)和2D-LC-MS/MS法进行蛋白质鉴定和相对定量。ELISA法进一步验证血清中候选标志物含量。结果与对照组相比,实验组中共鉴定出有定量信息的蛋白质106个,其中差异1.5倍以上的有38个,包括26个上调蛋白和12个下调蛋白。其中血清铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)上调明显,高达2.4倍。ELISA法进一步证实,实验组CP含量明显高于对照组(P<0.05)。结论基于i TRAQ技术的蛋白质组学方法能鉴定出多种DS相关的差异蛋白,CP可作为DS筛查的新标志物。

稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用

蛋白质表达水平定量分析是蛋白质组学研究的一项关键内容,它依赖于精确的、高通量的、具重复性的技术。目前,应用稳定同位素标记技术定量蛋白质表达水平是最准确的方法之一,且联合色谱质谱技术更具优势。本文论述了这一技术的广泛应用和最新的研究进展。

基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力

为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。

基于iTRAQ蛋白质组学的OsAAP6不同转基因水稻胚乳差异蛋白筛选

【目的】基于iTRAQ蛋白质组学筛选不同OsAAP6转基因水稻胚乳的差异蛋白,明确胚乳中的差异蛋白,以期为后续利用OsAAP6基因提升稻米的营养品质提供理论依据。【方法】以水稻OsAAP6超量表达阳性[OX(+)]和阴性对照[OX(-)]材料及OsAAP6互补表达阳性[ZpZc(+)]和阴性对照[ZpZc(-)]为试验材料,采用同位素标记相对与绝对定量(iTRAQ)技术对其进行蛋白质组学检测分析,并利用考马斯亮蓝G-250法对其胚乳中的4类储藏蛋白(谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白)进行含量检测。【结果】与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性胚乳中OsAAP6基因的表达量分别在P<0.01和P<0.001水平极显著升高。与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性水稻共有58种差异蛋白共同上调或下调表达,其中有39种蛋白显著增加(P<0.05,下同),有19种蛋白显著降低。在39种共同上调表达的蛋白中有27种蛋白参与水稻种子储藏底物的合成与积累,且有16种上调表达蛋白参与种子储藏蛋白的代谢和积累。与ZpZc(-)和OX(-)转基因阴性对照相比,ZpZc(+)和OX(+)转基因阳性水稻胚乳中的谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量均显著增加。【结论】OsAAP6基因上调表达,能抑制与支链淀粉合成相关蛋白的积累,但能促进其胚乳中储藏蛋白的积累,进而提高胚乳中谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白含量,可用于高蛋白水稻新品种的分子育种和遗传改良。

稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的应用

传统的蛋白质组定量策略主要是通过双向凝胶电泳来进行相对定量。由于该方法不能对相对分子质量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和检测,所以已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要。近年来,定量蛋白质组学的发展主要是以同位素亲和标签试剂为代表的、以质谱检测为核心的稳定同位素化学标记方法。稳定同位素化学标记结合质谱技术,使定量蛋白质组的分析更趋简单、准确和快速,具有良好的发展前景。本文对稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的研究进展进行了评述。

应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学方法筛选浆细胞性乳腺炎病人差异表达蛋白质

目的分析浆细胞性乳腺炎组织的蛋白表达谱,寻找浆细胞性乳腺炎的关键分子。方法选择4例浆细胞性乳腺炎病人,术中留取病灶组织、正常组织标本,提取蛋白,采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术分析在浆细胞性乳腺炎中差异表达的蛋白质,并进行功能富集分析。结果在浆细胞性乳腺炎中,鉴定出915个差异蛋白(上调795个蛋白,下调120个蛋白)。功能富集分析表明这些差异蛋白主要参与细胞黏附、炎症反应等。KEGG通路分析发现,这些差异蛋白主要参与免疫系统相关信号通路。结论浆细胞乳腺炎中差异表达的蛋白质,参与了相关信号通路,可能是浆细胞性乳腺炎发生发展的关键分子。

基于非标记定量蛋白质组学技术筛选阿尔茨海默病细胞模型的生物标记物

目的研究Aβ诱导SH-SY5Y细胞构建阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,AD)细胞模型蛋白质组学,并筛选该细胞模型潜在的生物标记物。方法将培养的SH-SY5Y细胞分为正常对照组和Aβ寡聚体诱导AD细胞模型组,通过非标记液相色谱-串联质谱技术对正常对照组和AD组进行比较蛋白质组学分析,并结合生物信息学分析,对筛选出的差异蛋白进行GO富集分析、KEGG通路注释、PPI网络构建。结果成功鉴定到2512个蛋白质,根据符合表达差异倍数大于2倍(上下调)和统计学显著性(P<0.05)标准进行筛选,得到了336个差异蛋白质,B组中共172个表达上调的蛋白,164个表达下调的蛋白。差异蛋白的KEGG通路注释结果显示,阿尔茨海默通路(hsa05010Alzheimer’s disease,P<0.05)通路发生显著性变化,结合GO富集分析,在鉴定到的差异蛋白中,发现APP、HSD17B10、NDUFA5、LPL表达量在AD细胞模型组与正常对照组中表达具有显著性差异。结论APP、HSD17B10、NDUFA5、LPL具有作为Aβ1-42诱导SH-SY5Y构建AD细胞模型生物标记物的潜能。

同位素标记相对和绝对定量技术在药物蛋白质组学研究中的应用

目的建立应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术进行药物蛋白质组学研究的技术平台。方法分别测定12例高血压患者在给予降压药氨氯地平治疗前和治疗后8周的收缩压和舒张压,并同时收集患者在降压药治疗前和治疗后8周的血清,应用蛋白质组学iTRAQ技术对治疗前后的血清蛋白质组进行定量分析。结果高血压患者口服降压药苯磺酸氨氯地平片8周后平均收缩压和舒张压均明显降低(P<0.01)。经iTRAQ和ProteinPilot软件分析,共鉴定出232个差异蛋白质,其中降压药物治疗后表达上调和下调超过1.5倍的蛋白质分别有12种和13种。上调的蛋白质主要参与应激、防御和免疫反应,而下调的蛋白质主要参与应激、防御、炎症和凝血反应。本研究结果提示,降压药氨氯地平治疗可以双向调节机体的应激和防御反应,可以增强机体的免疫力,抑制炎症反应和改善高血凝状态,从而有利于血压的降低。结论应用iTRAQ技术进行药物蛋白质组学研究可筛选获得多种与药物疗效相关的差异蛋白质,为药物作用靶点和分子机制等方面的研究提供了一个良好的技术平台。