单核细胞增生性李斯特菌iap基因的原核表达

该研究利用自行设计的引物通过PCR方法扩增出单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes C5305株的iap基因，在iap基因的5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点并将其克隆到pET-28a表达载体上，经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷酸序列测定后获得重组质粒pET-28a—iap，将该重组质粒转化入大肠杆菌B121（DE3）pLysS，经1mmol／LIPTG诱导4—6h后，通过SDS—PAGE及Westem-blotting鉴定，证明该基因得到表达，表达产物相对分子质量约为60000，以可溶形式存在．

杆状病毒IAP基因的结构、功能及其进化

杆状病毒的IAP(inh ib itor of apoptosis prote in)基因是最早鉴定的IAP家族基因,具有B IR和R ING结构域特征,与杆状病毒P35基因有相似抗细胞凋亡功能,但在结构和作用机制上存在差异。系统分析表明,杆状病毒IAP基因可能是病毒与鳞翅目昆虫在长期的进化过程中从宿主基因组中获得的。

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。

单核细胞增多性李斯特菌iap基因的克隆、表达与p60蛋白的纯化

以单增李斯特菌基因组DNA为模板,利用自行设计的引物,通过PCR法扩增出单增李斯特菌的iap基因。在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ2个酶切位点将其克隆到pMD-18T载体上,构建克隆载体pMD-18T-iap。经测序正确后,将iap基因克隆至表达载体pET-28a上构建表达质粒pET-28a-iap。在IPTG诱导下,携带pET-28a-iap的E.coliBL21(DE3)高效表达分子质量约为60kD的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白,其中可溶性蛋白占总p60蛋白含量的76.3%左右。诱导表达的可溶性蛋白通过Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度在95.6%以上的重组p60蛋白,其提取率为68.3%左右。

单核细胞增生性李斯特菌iap基因克隆和PCR条件优化

目的构建单核细胞增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes54002—4株p60蛋白iap基因原核克隆载体。方法利用自行设计的引物通过梯度PCR优化扩增条件，扩增出单核细胞增生性李斯特菌54002—4株的iap基因。在iap基因的5’端和3’端分别引入BamHI和XhoI2个酶切位点，琼脂糖凝胶电泳分析、回收PCR产物，并将回收纯化的PCR产物与pMD18．T载体进行连接。将该重组质粒转化入大肠杆菌JMl09感受态细胞，经1mmol／LIPTG诱导4～6h后，观察转化效果。结果培养无色菌落细菌，提取质粒，经PCR鉴定和核苷酸序列测定后确定获得阳性重组质粒pMDl8-T—IaP。结论通过梯度PCR摸索出最佳反应条件，建立PCR优化条件和方法，经转化获得iap基因克隆载体。

家蚕核型多角体病毒凋亡抑制基因iap的功能分析

在昆虫杆状病毒基因组中普遍存在一类凋亡抑制基因iap(inhibitor of apotosis)。核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的iap1和iap2基因为研究对象,分别构建BmNPV iap1、BmNPV iap2缺失型和补回型病毒,探究2个iap基因的生物学功能。病毒基因组DNA对BmN细胞的转染实验结果表明,BmNPV iap1基因缺失对病毒感染引起的细胞凋亡无显著影响,对病毒基因组的复制和基因转录也无明显影响;但BmNPV iap2基因的缺失可显著提高细胞的凋亡水平(P<0.05),当利用iap2缺失型病毒基因组DNA转染BmN细胞时,胞内凋亡启动蛋白Caspase-3的活性与野生型病毒转染组相比显著上升,并且病毒滴度降为0。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,BmNPV iap2的缺失大大降低了病毒DNA的复制水平和基因转录水平。基于上述试验结果可知:BmNPV iap2具有抑制由病毒感染诱导的细胞凋亡的作用,并且是病毒增殖的必需基因;而BmNPV iap1对宿主细胞的凋亡没有明显调控作用,对病毒基因组DNA的复制和基因转录也没有明显影响。

RNAi介导的HvIAP1基因沉默对茄二十八星瓢虫存活和发育的影响

RNAi抗虫技术,是一种新型绿色环保的害虫防控方法,具有广阔的应用前景。茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata是茄科植物上的重要害虫,对作物生产造成了严重的经济损失。本研究用饲喂法RNAi探究了沉默凋亡抑制蛋白1(inhibitor of apoptosis protein 1,IAP1)表达对茄二十八星瓢虫生长发育的影响。结果显示,HvIAP1在茄二十八星瓢虫的每个发育阶段均表达,1龄幼虫和3龄幼虫的表达量最高,成虫的表达量最低。取食200 ng/μL ds HvIAP1浸泡处理的叶片2 d后,可导致92%的茄二十八星瓢虫1龄幼虫死亡,同时在取食ds HvIAP124 h后,HvIAP1基因的表达量下降了2.40倍;另外,单头取食200 ng的ds HvIAP1可导致70%的4龄幼虫死亡,同时在取食48 h后,HvIAP1基因的表达量下降了2.58倍。并且RNAi处理后1龄幼虫和4龄幼虫大部分个体在48 h内出现急性取食障碍现象,基本不取食直至死亡。上述结果表明,HvIAP1基因在茄二十八星瓢虫的生长发育过程中起重要作用,当该基因表达受阻,会直接影响茄二十八星瓢虫的取食、抑制其生长发育而死亡。这一研究表明HvIAP1基因可作为潜在的防治茄二十八星瓢虫的RNAi靶标基因。

杆状病毒凋亡抑制基因的研究进展

杆状病毒(bacu lovirus)感染昆虫细胞能引起细胞凋亡,但在长期进化过程中,杆状病毒可通过自身编码凋亡抑制基因的表达,抑制细胞凋亡以利于自己的增殖。目前在杆状病毒基因组中已发现两种不同类型的细胞凋亡抑制基因p35/p49和iap,这两类凋亡抑制基因分别作用于细胞凋亡途径的不同位点,以抑制细胞的凋亡。近年来人们对这两种基因的蛋白结构及作用机制等方面进行了大量的研究,这些为今后研究昆虫细胞凋亡,扩大杆状病毒宿主范围等方面奠定了基础。

昆虫杆状病毒细胞凋亡相关基因的研究进展

细胞凋亡(Apoptosis)或细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD),最早被Kerr(1972)定义为一种有秩序、受控制并按某种预定程序发展的细胞生理性自然死亡过程.

杆状病毒凋亡抑制基因

杆状病毒(baculoviruses)感染昆虫细胞会引发细胞凋亡,然而病毒为了确保自身的复制和繁殖会抑制宿主细胞的凋亡。杆状病毒在长期进化过程中获得了凋亡抑制基因,如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica MNPV,AcMNPV)中的p35基因,棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组中的IAP基因家族,以及莲纹夜蛾核形多角体病毒(Spodoptera littoralismulticapsid nucleopolyhedrovirus,SpliMNPV)的p49基因等。尽管这些基因都具有抑制细胞凋亡的功能,但是作用途径和方式却各有差异。对杆状病毒3种抗凋亡基因的结构和功能作一简单的介绍和评述。

斜纹夜蛾核型多角体病毒安徽和县株系细胞凋亡抑制相关基因的克隆与遗传变异

为分析核型多角体病毒(NPV)分离株内细胞凋亡抑制相关基因的多态性,从安徽和县采集感染病毒的斜纹夜蛾病虫,分离出斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,Splt NPV)15个活体克隆株系,研究其细胞凋亡抑制基因(IAP)和P49基因多态性。发现15个Splt NPV安徽和县克隆株系中的IAP基因序列均无差异,且与已报道的Splt NPV中国G2株的同源性达100%;Splt NPV各克隆株系中的P49基因序列也无差异,且与Splt NPV中国G2株的P49基因同源性达99%。表明Splt NPV安徽和县株系IAP和P49基因均较为保守,没有表现出遗传变异。

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的快速检测方法,本研究以LMiap基因为靶基因设计合成引物及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR快速检测LM的方法。结果显示,对15株试验菌株进行实时荧光定量PCR检测,只有LM菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为6.5CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的139份样品进行检测,共计检出3份LM阳性样品,与国标法(GB 478930-2010)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。

棉铃虫核多角体病毒iap3基因表达时相分析

目的:原核表达棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV)iap3基因,制备该蛋白的多克隆抗体,并利用该抗体分析iap3基因在病毒感染过程的表达时相,为深入研究提供基础。方法:PCR扩增iap3基因后,克隆至pET28b,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,利用亲合层析进行蛋白纯化,将纯化融合蛋白免疫大鼠制备抗血清,利用抗血清Western blot检测IAP3在病毒感染过程的表达时相。结果:成功在原核细胞中表达iap3基因,并获得纯化的融合His-tag的IAP3蛋白,制备了该蛋白的多克隆抗体。发现iap3基因最早在感染后24h表达,到72h到达表达高峰。结论:获得了IAP3多克隆抗体,iap3基因是一个晚期表达基因。

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。

基于双启动引物特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的PCR方法

以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因，利用一新型PCR引物设计方法——双启动引物（Dual-primingoligonucleotide，DPO），建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO—PCR方法，测试了DPO—PCR方法退火温度不敏感性、特异性及灵敏度，并在实践检测中进行了初步应用。结果显示：该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为1．51×10^2CFU／mL；退火温度不敏感性测试中，与常规PCR引物相比，DPO引物在48～68℃退火温度范围内均能够高效率地扩增靶基因；特异性测试中，DPO—PCR方法能特异地检测出目标菌，与其他菌株无非特异性扩增反应，比常规PCR方法显示出更强的特异性。实践应用证明，利用DPO—PCR方法对130份样本进行检测，共计检出9份单核细胞增生李斯特氏菌阳性样本，经国标法（GB／T4789．30—2008）复检，两者检测结果一致，显示出良好的实用性，为单核细胞增生李斯特氏菌的快速准确检测提供了新方法。

三重PCR鉴定消毒牛奶及其加工环境中的单核细胞增生李斯特菌

目的 建立三重PCR体系用于鉴别消毒奶及其加工环境中的单核细胞增生李斯特菌。方法 以李斯特菌属细菌中共有的编码P60蛋白的iap基因和单核细胞增生李斯特菌特有的编码溶血素的hly基因为靶目标设计引物，用于三重PCR扩增。结果 李斯特菌属细菌的iap基因在二重PCR的扩增片断为1．45kb，单核细胞增生李斯特菌溶血素的hly基因的扩增片断为420bp；在三重PCR体系中单核细胞增生李斯特菌除了扩增到420bp的hly基因片断以外，iap基因以700bp的小片断取代了1．45kb的大片段，而同属的其他细菌仍旧扩增iap基因1．45kb的大片段。结论 所建立的三重PCR法能扩增出李斯特菌属细菌的预期条带，此方法对肉汤培养物的检测灵敏度为3．2×10^1 cfu／ml，对人工污染牛奶的检测灵敏度为1．4×10%2cfu／ml。高水平L．innocua（10^8cfu／m1）共存不影响单核细胞增生李斯特菌的特异性检出。三重PCR还可以直接鉴别出培养3～6小时后的含有单核细胞增生李斯特菌（1．45×10^0～1．45×10^1 cfu／m1）的牛奶。

双重TaqMan实时荧光PCR同时检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

以建立沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌双重Taq Man PCR方法为例,阐述Taq Man PCR方法建立的系统步骤和关键要素为目的,采用根据沙门氏菌Fim Y和单核细胞增生李斯特菌iap基因序列利用ABI primer express 3.0软件设计了物种特异性引物和Taq Man探针,采用标准曲线优化法对双重反应体系中引物和探针、Mg2+、d NTP浓度和Taq酶用量以及热循环条件等关键要素进行了优化,借助单双重PCR比较试验、多重PCR高低丰度模板抑制试验、灵敏度、特异性和重复性试验对建立的方法进行了验证进而得出了这样的结果:我们建立了涵盖设计要素、质控设置、体系优化、评价指标、验证试验共5个关键环节的双重Taq Man实时荧光PCR方法建立模式。建立的方法灵敏度高,沙门氏菌100CFU/ml,单增750CFU/ml;特异性强,对8种阳性菌株和37种近缘及远缘关系的阴性菌株成功鉴别的方法。本研究可借鉴应用于所有以核酸为检测对象的Taq Man PCR方法的建立模式。

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒iap1和iap2基因功能分析

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)基因组含有3个细胞凋亡抑制基因,即p35,iap1和iap2.其中,p35作为一个有效的依赖于天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制因子,能够抑制多种因素诱发细胞凋亡,而iap1和iap2的功能仍未完全明晰,本研究对IAP1和IAP2的功能进行了详细分析.缺失了p35的AcMNPV仍可抑制棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid NPV,HearNPV)诱导的BTI-Tn-5B1-4(Tn-Hi5)细胞凋亡并挽救HearNPV在Tn-Hi5细胞中复制及HearNPV出芽型病毒粒子的产生.进一步构建了瞬时表达质粒以及分别表达AcMNPV的p35,iap1和iap2基因的重组HearNPV,转染瞬时表达的IAP1和IAP2对HearNPV感染诱导的Tn-Hi5细胞凋亡有抑制效果,而重组病毒感染Tn-Hi5细胞也可抑制其凋亡并在其中复制,然而重组HearNPV表达的p35,iap1和iap2并未能挽救出芽型病毒粒子的产生.结果表明,AcMNPV的iap1和iap2基因表达产物作为细胞凋亡抑制因子是有功能的。

食品中单核细胞增生李斯特菌株的分离及聚合酶链式反应鉴定

目的建立单核细胞增生李斯特菌的聚合酶链式反应(PCR)检测方法,了解市售食品中单核细胞增生李斯特菌的污染情况。方法采集成都市市售生畜肉、生禽肉、熟肉制品、水产品、生食蔬菜以及其他熟食等食品样品共135份,采用李氏增菌肉汤(LB1,LB2)进行初增菌,应用选择性分离培养基PALCAM和在TSA-YE平板上进行分离,利用单增李斯特显色平板进行鉴定;根据李斯特菌的特异性基因iap基因设计引物,采用PCR方法检测所有分离的李斯特菌株;根据单增李斯特菌的特异性基因hly基因和prfA基因设计引物检测单核细胞增生李斯特菌株。结果 135份样品中共检出李斯特菌17株,检出率为12.6%;其中单核细胞增生李斯特菌4株,检出率为3.0%。结论本研究建立的PCR方法具有特异性,本市市售食品不同程度受到李斯特菌的污染。