钾通道拮抗剂IBTX对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的试验研究

目的:探讨大鼠脑缺血再灌注损伤后,海马CAl区锥体细胞caspaso-3表达及细胞凋亡的变化及使用钾通道拮抗剂IBTX(ibetiotoxin)的保护作用及其保护机制。方法:通过腹腔注射硝普钠加双侧颈总动脉夹闭建立大鼠全脑缺血一再灌模型,侧脑室注射IBTX,免疫组化法测caspase-3表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:大鼠全脑缺血-再灌注24小时后,海马CAl区锥体细胞caspase-3阳性表达,TUNEL法检测有细胞凋亡,在用药IBTX组,caspase-3阳性表达减少,TUNEI法检测细胞凋亡亦有明显降低。结论:大鼠全脑缺血-再灌注24小时后海马CAl区锥体细胞出现细胞凋亡,使用钾通道拮抗剂IBTX可减少细胞凋亡的发生,从而发挥保护作用。

不同标签辅助的IBTX原核表达纯化及活性鉴定

目的:在原核体系中建立高效表达纯化IBTX(Iberiotoxin)的工艺,并比较不同标签对IBTX生物活性的影响。方法:利用引物搭桥的方法,经PCR扩增,获得IBTX编码基因,以此为模板分别构建了表达质粒PET32a(+)-IBTX、pGex-6p-1-IBTX、pDuet-MBP-IBTX,并将其转入E.coli(BL21)分别表达带有硫氧还原蛋白(TRX)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的IBTX融合蛋白,在经过亲和层析、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶酶切、C18反向层析纯化后真空冻干得到IBTX干粉,以电生理实验检测其生物活性。结果:在三种标签帮助下通过原核体系表达出的IBTX都能够特异性的阻断大电导Ca2+激活的钾通道(BK)电流,其中MBP帮助折叠的m-IBTX活性最佳。结论:建立了IBTX在MBP标签帮助下的原核表达纯化工艺,为进一步研究蝎钾离子通道α家族神经毒素及其突变体的原核表达奠定了基础。

黄芩苷增强SD大鼠脑中动脉平滑肌细胞BK通道介导的外向电流

目的研究黄芩苷对SD大鼠脑中动脉的影响。方法应用压力型小动脉测量仪观察给予黄芩苷前后脑中动脉直径的变化;应用全细胞膜片钳技术和内面向外式膜片钳技术观察黄芩苷对离体的SD大鼠脑中动脉SMC电流的调节作用。结果黄芩苷舒张SD大鼠脑中动脉血管段呈浓度依赖性。BK通道阻断剂ibTX阻断黄芩苷的舒张作用。黄芩苷增强脑中动脉SMC外向电流呈浓度依赖性。BK通道阻断剂ibTX阻断黄芩苷介导的脑中动脉SMC外向电流。黄芩苷增加BK通道开放频率。结论黄芩苷增加BK通道开放频率,增强其介导的外向电流,舒张SD大鼠脑中动脉血管。