猪肉中2-(三氟甲基)吩噻嗪的Ic-ELISA检测

为了快速检测猪肉中的镇静剂2-(三氟甲基)吩噻嗪(2-(trifluoromethyl)phenothiazine,TFPTZ),分别用偶氮苯甲酸法、混合酸酐法合成了半抗原、完全抗原,通过免疫新西兰大耳白兔获得了多克隆抗体,采用间接竞争酶联免疫方法(Ic-ELISA)对猪肉中TFPTZ进行了定量分析,实验条件:包被抗原浓度1.25μg/mL,多克隆抗体稀释16000倍,37℃包被3 h,封闭液为质量分数1%的牛血清白蛋白(BSA),TFPTZ稀释液为含体积分数10%的DMSO的PBS,竞争反应60 min.该方法相关系数R^(2)为0.9991,IC_(50)为1.5002μg/L,最低检测限IC_(10)为0.2841μg/L,线性(IC_(20)~IC_(80))为0.4307~5.2252μg/L,与5种TFPTZ结构类似物的交叉反应率小于1.2%,样品添加回收率为93.26%~109.13%,变异系数小于6%,实际样品检测结果与高效液相色谱法测定结果高度一致,表明建立的快速检测猪肉中TFPTZ的Ic-ELISA方法具有良好的准确度,适用于快速检测猪肉中TFPTZ的残留量.

ic-ELISA法测定不同厂家双黄连口服液中黄芩苷的含量

目的：建立一种快速、灵敏的黄芩苷免疫分析检测方法,并采用该新方法比较不同厂家双黄连口服液中黄芩苷含量的差异。方法：利用黄芩苷单克隆抗体,通过对线性关系、精密度、加样回收率等方法学指标的考察,建立黄芩苷的ic-ELISA分析方法。结果：该研究建立的线性范围为256~4 096 ng/m L,板间差异不超过8.8%,板内差异最大为3.8%,平均回收率为100.1%（RSD为4.3%）。不同厂家生产的双黄连口服液中黄芩苷含量均符合2010年版中国药典一部规定。结论：该研究所建立的ic-ELISA方法准确、简便、可行,重现性好,为黄芩苷的含量测定提供了一种新方法,且新方法测得不同厂家的双黄连口服液中黄芩苷的含量没有显著差异。

抗噻菌灵单克隆抗体的制备及异源IC-ELISA检测方法的建立

为建立噻菌灵酶免疫检测方法,制备3种噻菌灵的半抗原(H1、H2和H3)。利用活泼酯法制备免疫抗原H1-BSA、H3-BSA和包被抗原H1-OVA、H2-OVA、H3-OVA。采用杂交瘤细胞融合方法获得4株稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株,分别命名为1-4G9、1-6D3、3-1F9和3-5D4。采用间接竞争酶联免疫法(IC-ELISA),将上述4株抗体分别与3种包被抗原进行组合,从中选择出一个最优组合:H3-OVA/1-6D3。据此建立的异源IC-ELISA检测方法对噻菌灵的IC50为10.9μg.L-1,检测限(IC10)为2.2μg.L-1,与3种噻菌灵类似物的交叉反应率均小于0.1%;在自来水、苹果、梨的添加回收试验中,IC-ELISA法测定的回收率依次为95.9%～118.1%、90.0%～117.6%、74.9%～95.6%;HPLC法测定的回收率依次为92.7%～97.6%、98.9%～100.9%、91.6%～105.4%,IC-ELISA法与HPLC法测定结果基本一致。上述结果表明:抗噻菌灵单克隆抗体酶免疫检测具有很强的特异性和准确性。

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白(ovalbumin,OVA)偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测(indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)方法。结果:在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%~111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论:成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。

环丙沙星间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法的建立

目的：建立环丙沙星残留的间接竞争ELISA检测方法。方法：用卵清白蛋白与环丙沙星偶联物做包被抗原,标准环丙沙星做竞争抗原,建立间接竞争ELISA方法,并用数学方法对结果进行了分析。结果：所建立的ELISA检测方法,最低检测限为2.77 ng/ml,检测范围为2.77～500 ng/ml。曲线回归方程为Y=-36.458X＋110.98,相关系数r2=0.9946。结论：该ELISA方法可以用于环丙沙星残留的快速检测。

基于抗大豆苷单克隆抗体的Ic-ELISA方法的建立

目的：建立大豆苷的快速免疫分析检测方法。方法：该研究通过大豆苷单克隆抗体与葛根素、芦丁等共9种中药小分子的交叉反应证明该抗体具有特异性,并以制备出的大豆苷特异性单克隆抗体为基础,建立了大豆苷间接竞争酶联免疫分析方法（Ic-ELISA）,并用此方法检测大豆中大豆苷的含量。结果：抗体与葛根素的交叉反应率为115%,与芦丁、甘草酸、栀子苷等小分子无交叉反应。该方法线性范围为10~10 000 ng·m L^-1,孔内差和板间差均小于6.3%,平均回收率为105.4%%。采用该方法检测大豆中大豆苷的含量,所得结果与HPLC法的结果一致。结论：该研究建立了大豆苷的Ic-ELISA方法,可为含大豆苷的中药及复方的质量控制分析提供更加快速灵敏的检测方法。

烯酰吗啉人工抗原的合成及其ic-ELISA方法的建立

目的:旨在建立一种可定量检测果蔬中烯酰吗啉残留的间接竞争酶联免疫吸附检测(Indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)方法。方法:首先合成烯酰吗啉半抗原,通过活泼酯法与钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)及牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)偶联获得免疫抗原DMM-KLH和包被抗原DMM-BSA;通过杂交瘤技术获得1株能够稳定分泌烯酰吗啉的单克隆抗体细胞株DMM-2C4,并通过腹水制备大量抗体。建立烯酰吗啉的ic-ELISA检测方法。结果:烯酰吗啉IC_(50)为2.05 ng/mL,检测限为0.35 ng/mL,与其他真菌杀菌剂无交叉反应。在果蔬中的添加回收率为68.3%~115.5%。结论:该方法能有效应用于果蔬中烯酰吗啉的快速检测。

食品中黄曲霉毒素M_(1)的间接竞争酶联免疫法的建立

该文建立一种间接竞争酶联免疫法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)快速测定食品中黄曲霉毒素M_(1)(aflatoxin M_(1),AFM_(1))的分析方法。AFM_(1)标准品用甲醇稀释,AFM_(1)标准品与AFM_(1)全抗原竞争结合AFM_(1)单克隆抗体,利用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)单组分显色液显色后,酶标仪测定吸光度。在优化好的条件下,浓度范围为9.743~2.605×10^(3)pg/mL时具有良好的线性关系,相关系数(determination coefficient,R^(2))为0.9927,检出限IC_(10)为3.84 pg/mL,加标回收率为88.43%~105.75%。该方法适用性好、操作简单、灵敏度高,满足食品中AFM_(1)分析检测的需求。

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒g G蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV g G蛋白,并采用切胶纯化该重组g G蛋白(rg G)后经western blot检测纯化的rg G (P-rg G)与本研究室制备的g G蛋白单克隆抗体(MAb) 3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示,P-rg G与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200。以P-rg G作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV g G蛋白间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示,P-rg G包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min。将待检样品的抑制率(PI)≥31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID_(50)),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rg G分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1∶320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID_(50)/0.1 m L;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%。利用该方法及荧光定量PCR (q PCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60)。q PCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%。本研究建立的ILTV g G蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段。

水产品中氯霉素酶联免疫吸附分析法的构建与应用

以氯霉素(CAP)为研究对象,通过系统优化反应条件,构建CAP的间接竞争酶联免疫分析法,并应用于水产品中CAP残留量的检测。氯霉素间接竞争酶联免疫分析方法的最佳工作条件为:0.05μg/孔包被量(CAP-OVA),4℃包被14 h,0.5%脱脂乳粉封闭液,CAP抗体稀释倍数为1∶16000。结果表明:构建的间接竞争酶联免疫分析方法的灵敏度(IC50)为4.88μg/mL,检测限(IC15)为0.29μg/mL,方法特异性良好,对氯霉素结构类似物和同类抗生素的交叉率低于0.1%。对大黄鱼、缢蛏、牛蛙进行5.0,10.0μg/kg和20.0μg/kg加标回收试验,回收率在83.90%~100.73%范围。本方法的日内和日间变异系数范围为2.28%~6.96%,该检测结果与LC-MS/MS分析结果具有良好的一致。本研究构建的CAP酶联免疫吸附分析法操作简单,灵敏度高,可应用于多种水产品中氯霉素残留量的快速定量检测,同时也为其它小分子危害物的酶联免疫分析方法的构建提供技术借鉴。

酶联免疫法快速检测保健食品中吲哚美辛和阿西美辛

针对保健食品中吲哚美辛和阿西美辛的非法添加问题,以吲哚美辛和阿西美辛分别作为免疫半抗原和包被半抗原,通过活泼酯法与载体蛋白偶联制备完全抗原,免疫动物筛选获得了可同时识别吲哚美辛和阿西美辛的兔多克隆抗体,并建立了抗风湿类保健食品中吲哚美辛和阿西美辛同时检测的间接竞争酶联免疫分析方法。方法对吲哚美辛的检出限为0.3 ng/mL,半抑制质量浓度(IC 50)为5.6 ng/mL,线性范围为0.9~32.9 ng/mL;对阿西美辛的检出限为1.1 ng/mL,IC 50为7.4 ng/mL,线性范围为2.2~24.3 ng/mL;与多种非甾体抗炎药无交叉反应。片剂、硬胶囊和软胶囊3种剂型的抗风湿类保健食品经甲醇超声提取,通过标准稀释液稀释消除基质效应,吲哚美辛和阿西美辛的添加回收率为80.0%~119.7%,相对标准偏差低于15%;检测结果与液相色谱-串联质谱法检测结果的线性相关系数均大于0.99,结果一致性良好,可用于保健食品中吲哚美辛和阿西美辛的快速筛查。

精喹禾灵酶联免疫吸咐分析(ELISA)研究

【目的】制备精喹禾灵的特异性抗体并建立精喹禾灵的间接竞争ELISA测定方法。【方法】精喹禾灵在碱性条件下水解合成了半抗原精喹禾灵酸,并与载体蛋白BSA和OVA偶联,分别合成了免疫抗原和包被抗原,偶联比分别为29.23和7.87。将Hapten-BSA免疫兔子获得多克隆抗体。【结果】抗血清的效价为200000。经酶联免疫吸附反应分析(ELISA)测定,精喹禾灵的抑制中浓度(IC50)为0.03495μg·ml-1,最低检测浓度(IC10)为0.002μg·ml-1,检测范围为0.002～0.5μg·ml-1。其与结构相似的物质几乎没有交叉反应,表明该方法具有很强的特异性,且在水样中的添加回收率为89.02%～108.88%。【结论】成功获得精喹禾灵特异性抗体并建立了水样中精喹禾灵农药残留的ELISA测定方法。

纸质玩具中BPA和BPS化合物的迁移

目的研究纸质玩具中双酚A(BPA)和双酚S(BPS)经口暴露途径下的迁移规律,并考察BPA和BPS迁移的适用性。方法采用间接酶联免疫(IC-ELISA)检测方法和Fick第二定律研究不同温度(4,37,60℃)、盐浓度(0.001,0.01,0.1 mol/L)、pH(4,7,9)条件下双酚类物质经口暴露下的迁移规律,模拟纸质玩具中BPA和BPS的迁移过程。结果双酚类物质迁移量与温度和盐离子浓度呈正相关,且在酸性和碱性条件的模拟液中溶出增加,纸质玩具中BPA和BPS经口暴露途径下的迁移规律符合Fick第二定律。正常迁移模拟条件下(37℃、盐浓度0.01 mol/L、pH=7的唾液模拟液)测得BPA和BPS的迁移系数分别为1.3×10^(-17),6.6×10^(18)cm^(2)/s。结论基于酶免疫检测方法,构建了纸质玩具中BPA和BPS的迁移模型,并成功应用于预测纸质玩具中双酚类化合物的迁移情况,根据纸质玩具中双酚类物质的迁移模拟实验,计算双酚类物质在不同条件下的扩散系数,并拟合迁移模型,预测盲样中BPA和BPS的迁移情况,与实际迁移情况对比,结果表明理论预测值与实际迁移量基本一致,此项工作对于儿童纸质玩具中双酚类物质的风险性评估具有重要意义。

双酚A二环氧甘油醚的免疫检测方法研究

目的快速检测湖水中的双酚A二环氧甘油醚。方法试验设计一种新型双酚A二环氧甘油醚半抗原,并成功与载体蛋白偶联,经过小鼠免疫、细胞融合技术和三次亚克隆等方法,成功筛选出了可以稳定分泌BADGE单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果成功制备了高灵敏度高特异性的双酚A二环氧甘油醚单克隆抗体,可以用于针对双酚A二环氧甘油醚的间接竞争酶联免疫吸附测定(ic-ELISA)。基于单克隆抗体,绘制了标准曲线,结果显示,单克隆抗体的IC50=1.15 ng/mL,检测线性范围IC20~IC80为0.16~8.15 ng/mL。通过加标回收实验,BADGE在湖水的添加回收率均在80%~120%之间。结论双酚A二环氧甘油醚单克隆抗体在实际湖水样品检测中的运用具有可行性。

抗3,4,4'-三氯联苯单克隆抗体的制备及其特性鉴定

采用含有4个碳原子臂长的PCB37半抗原衍生物合成PCB37全抗原,以人工抗原免疫BALB/C小鼠,通过鼠-鼠杂交瘤技术制备抗PCB37单克隆抗体。建立间接竞争ELISA（ic-ELISA）分析方法,对抗PCB37单克隆抗体的特性进行评估,最终获得了一株能够稳定分泌抗PCB37单克隆抗体的细胞株。使用该抗体建立了ic-ELISA,在PCB37浓度为0.10~50μg/L时,抑制率与PCB37的浓度呈线性关系,半数抑制浓度（IC50）为1.23μg/L,最低检测限（IC15）为0.027μg/L,与其他物质的交叉反应率〈5.5%。结果表明,成功研制了抗PCB37单克隆抗体,为进一步建立检测PCB37的免疫分析检测方法奠定了基础。

玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA方法的建立

本研究以玉米面为例,建立了玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA(ic-ELISA)方法。采用棋盘滴定法确定抗原和单抗的最佳工作浓度,并确定了抗原37℃包被1 h、不封闭、酶催化底物作用时间15 min的反应条件进行检测。该方法的检测范围(IC_(20)~IC_(80))为11~292 pg/mL,检测限(IC_(10))为6 pg/mL。玉米赤霉烯酮在玉米面中的加标回收率为81.29%~105.80%。本研究建立的ic-ELISA方法与赭曲霉素A、黄曲霉素B_(1)、呕吐毒素、伏马毒素B_(1)、T-2毒素无交叉反应,可用于玉米面中玉米赤霉烯酮的初筛检测。

4-戊基苯酚单克隆抗体的制备及其可变区的同源建模

目的制备4-戊基苯酚(4-AP)单克隆抗体(mAb),通过分子生物学方法对其可变区cDNA克隆和同源建模,为4-AP单链抗体制备及抗体分子层面改造奠定基础,同时为4-AP的免疫学检测提供一种新方法。方法将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0细胞融合,筛选出F10阳性单抗细胞株。通过其mRNA的抽提,克隆出可变区cDNA序列,利用生物软件进行同源建模和分子对接。结果在最适条件下,其间接竞争ELISA(ic-ELISA)公式为y=A_2+(A_1-A_2)/(1+(x/x_0)~p)(A_1=1.28;A_2=-0.07;x_0=12 560.75;p=0.74),相关系数(R^2)为0.997,其最低检测限为0.65μg/mL。mAb重链和轻链分别属于IgG1型和Kappa型,其与4-AP的结合力为氢键和疏水作用。结论成功制备出1株稳定分泌的4-AP mAb的杂交瘤细胞株。通过同源建模对抗体可变区空间结构进行深入研究,为单链抗体及抗体改造提供参考,同时为4-AP含量检测提供新方法。

有机磷农药广谱特异性单克隆抗体的制备及特性分析

本研究以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸(BPB)为半抗原,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联后免疫Balb/c小鼠。筛选获得1株杂交瘤细胞株,能够分泌广谱识别有机磷农药的单克隆抗体,而后建立间接竞争酶联免疫检测方法,并进行谷物添加方法验证。结果表明,所获得的单克隆抗体对14种有机磷农药具有识别作用,半抑制浓度(IC50)为0.165~38.274μg/ml,交叉反应率(CR)为5.0%~1 134.0%。其中对蝇毒磷、对硫磷、辛硫磷、喹硫磷4种农药具有较高的识别作用,IC50为0.165~0.873μg/ml,交叉反应率为214.0%~1 134.0%。利用建立的间接竞争酶联免疫检测方法对玉米、小麦样品进行添加回收验证,结果表明,该方法对对硫磷、蝇毒磷、辛硫磷、喹硫磷的回收率为79.2%~127.3%,变异系数均小于11.0%,所建立的方法可用于谷物中多种有机磷农药残留的快速检测。

副溶血性弧菌多克隆抗体制备及应用

以热灭活副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP ATCC17802)免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用间接酶联免疫吸附法测定抗血清效价,纯化后的多克隆抗体效价为512000。该抗体与5株副溶血性弧菌均能特异性结合,但与其他12株非副溶血性弧菌无交叉反应。在此基础之上建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA),并优化了抗原抗体浓度、二抗浓度、封闭液等条件。结果表明,该法的线性范围为5×10^4~107CFU/m L,线性回归方程为y=0.21x-0.74(R2=0.99),IC50为106CFU/m L,最低检出限为1.7×10^4CFU/m L,板内变异系数为2.61%~4.15%,板间变异系数为4.71%~8.74%。用建立的ic-ELISA检测市场中鱼、贝类养殖水和实验室用水中的VP,实验结果与国标检测方法的结果一致。该方法快速便捷,灵敏度高,准确性好,为进一步研究VP的快速检测奠定了基础。

基于特异性对硫磷单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附分析方法建立

【目的】制备特异性识别对硫磷(PA)的单克隆抗体,建立其间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),为实现对硫磷的农残快检提供技术支持。【方法】以化合物4-(二乙氧基硫代磷酸酯基)苯甲酸为半抗原,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,免疫7周龄Balb/c雌性小鼠,取抗血清效价最高、特异性最优小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用间接酶联免疫方法(i-ELISA)及ic-ELISA分别评价融合细胞株的阳性和特异性,通过有限稀释法筛选稳定分泌对硫磷抗体的单克隆细胞株。再通过棋盘格试验筛选出抗原抗体最佳工作浓度组合建立对硫磷ic-ELISA标准曲线,并基于对硫磷单克隆抗体与各结构类似物的交叉反应率,评估ic-ELISA的特异性。采购西红柿样品进行对硫磷的添加回收试验,运用气相色谱法(GC)验证ic-ELISA的准确性。【结果】成功合成对硫磷人工抗原PA-BSA和PA-OVA,经5次免疫后融合小鼠的血清效价为8×103;通过有限稀释法筛选获得灵敏度高、特异性最强的对硫磷单克隆细胞株4F11A10。以2μg/mL包被抗原PA-OVA、0.25μg/mL细胞株4F11A10分泌抗体为最佳抗原抗体工作浓度组合,建立对硫磷ic-ELISA及其标准曲线,其半抑制浓度(IC50)为50 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.34~300 ng/mL;所建立的对硫磷ic-ELISA与5种有机磷农药(丙溴磷、杀扑磷、倍硫磷、水胺硫磷和甲拌磷)均无交叉反应。对比ic-ELISA和GC测定西红柿样品中对硫磷的添加回收试验结果,发现ic-ELISA的添加回收率为84.86%~100.27%,GC的添加回收率为97.60%~106.40%,两种方法的检测结果一致性较好。【结论】建立的ic-ELISA可用于快速检测蔬菜、水果等农产品中的对硫磷残留。