Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列，应用PrimerPrimier5．0软件，在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物，成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带，从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带，设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒，特异性好；分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此，该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。

含非竞争性内标四重荧光RT-PCR方法检测手足口肠道病毒方法的研究

旨在了解手足口病的流行和感染情况,并进行快速准确的检测。建立了含非竞争性内标的同时检测肠道病毒通用型、肠道病毒EV71型及柯萨奇病毒CA16型的四重荧光RT-PCR方法,对该方法的特异性、灵敏度等进行评价,并对多份临床样本进行应用检测。结果表明,该检测方法特异性强,对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性;该检测方法对EV71型和CA16型的检测灵敏度分别达到31.25 TCID50和1.25×102TCID50;将浓度为1×104TCID50及5×102TCID50的EV71样本进行重复性试验,其变异系数均小于1.5%;将浓度为5×102-5×105TCID50的EV71和CA16样本进行线性试验,其相关系数R2值在0.982-0.998之间。采用本研究建立的方法检测40份疑似临床样本,最后检出31份肠道病毒阳性样本,其中8例EV71型阳性,13例CA16阳性。另外,试验数据表明,内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。本方法能同时快速检测所有肠道病毒并进行EV71型及CA16型的分型,并且灵敏度高、特异性好、扩增效率高,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合于手足口病的临床检测。

番茄内生菌分离及其ERIC-PCR指纹图谱分析

介绍了一种分离植物内生菌和研究其多样性的方法。用无菌水、化学试剂、紫外线和机械去表皮 4种方法对番茄植株进行处理 ,然后分别用牛肉膏蛋白胨、高氏一号和PDA(加链霉素抑制细菌生长 ) 3种培养基分离内生菌。确定了最适宜的去除非内生菌的方法。经分离、纯化得到 1 4 8株大小、形态、颜色各异的内生菌分离物。对其中 43株进行ERIC PCR扩增 ,32株有扩增条带的菌株可分为 2 8种。把纯化的菌株分别与番茄早疫病菌进行平板对峙培养。筛选出抑菌效果较好的

用核糖体DNA鉴别PCR区分中华按蚊和嗜人按蚊

目的：建立鉴别中华按蚊和嗜人按蚊的ＰＣＲ检测技术，并对现场标本进行检测。方法：根据中华按蚊和嗜人按蚊的ｒＤＮＡＩＴＳ２序列差异，设计种特异引物，用ＰＣＲ技术扩增种特异ＤＮＡ片段（中华按蚊４２５ｂｐ，嗜人按蚊２５３ｂｐ），根据扩增片段的长度对两种按蚊进行鉴别。结果：应用该法检测中华按蚊和嗜人按蚊的３个实验室品系共７０例，经卵鉴定的嗜人按蚊野外标本２０例，均显示单一的种特异扩增带。凉山按蚊、贵阳按蚊和帕氏按蚊对照共９例全部无扩增。检测采自我国１０省１２个不同地点，根据成蚊形态初步鉴定为中华按蚊的标本共４４０例，具中华按蚊种特异扩增带的标本占６６．１％，具嗜人按蚊种特异扩增带的标本占１２．７％，其余２１．１％的标本无扩增带，表明检测样本中混有其他蚊种，仅根据成蚊形态难以鉴别。结论：本研究提供了一种简便、准确和灵敏的中华按蚊和嗜人按蚊的分子鉴别方法。

树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究Ⅱ——Botryosphaeria属28S rDNA-PCR-RFLP和RAPD解析

BotryosphaeriaCes.etdeNot .(无性阶段是DothiorellaSacc .)属病原真菌能引起多种林木溃疡病的发生 ,在我国分布区域十分广泛。病原菌因较大的寄主范围和地理分布区域表现出明显的分子遗传分化 ,通过对来自 5个区 1 4个寄主种 (品种 )的 30个菌株进行 2 8SrDNA PCR RFLP和RAPD解析 ,结果表明 ,所有供试菌株都能扩增出稳定一致的 2 8SrDNA条带 ,6种内切酶不能区分该属内部的 2 8SrDNA差异。RAPD结果表现出该属丰富的多样性 (92 81 % ) ,在 0 845相似系数的水平上所有菌株被识别为 1 3类 ,其中有地理分化、寄主分化的表现 ,也有不表现地理、寄主分化的。从DNA水平上证实引起雪松溃疡病的病原为B .dothidea ,表明B .dothidea不仅能够寄生被子植物 ,还能寄生裸子植物 ,有非常宽阔的寄主范围。随机扩增引物K1 6和R1 4可以作为陕西菌株和湖南菌株与其它地区菌株区别的鉴别性引物。传统上认为苹果轮纹病菌 (B .berengerianadeNot.f.sp .piricola (Nose)KoganezawaetSakuma)为苹果干腐病菌 (B .berengerianabeNot.)的专化型 ,它们与杨树溃疡病原分属两个种。本试验分析表明这种分类较为合理。

PCR方法检测转基因烟草的研究

研究通过利用生物信息学手段,对烟草转基因的启动子、终止子和不同的目的基因序列进行了研究,设计了多种检测转基因烟草的PCR引物,建立了比较完整的转基因烟草PCR检测方法。

苹果汁和桃汁种类特异性PCR检测方法的研究

本文采用苹果属过敏原蛋白的mal d 4.02基因,桃属微卫星标记MA023a分别作为苹果汁和桃汁特异性引物,并以植物高度保守的叶绿体AccD基因作为内标物,利用PCR检测方法对两种果汁进行种属鉴定。结果表明,特异性PCR检测方法可以准确的对苹果和桃产品进行种属鉴定,苹果、桃属特异性PCR检测方法的最低检测限分别为5、10ng/μL,此方法能快速、准确对苹果汁和桃汁种类进行定性鉴定和掺假检测。

ITS结合RPS0两步PCR快速鉴定临床5种假丝酵母菌

目的:建立快速准确鉴定常见假丝酵母菌种类的基因检测技术。方法:提取假丝酵母菌基因组DNA;第一步PCR用通用引物扩增ITS基因;第二步三重PCR用种特异性引物扩增RPS0基因;分别对已知及未知样本检测、验证。结果:ITS基因扩增,光滑假丝酵母菌(Cg)和克柔假丝酵母菌(Ck)分别得到与预期结果吻合的881bp和419bp的PCR产物;白假丝酵母菌(Ca)、热带假丝酵母菌(Ct)和近平滑假丝酵母菌(Cp)的ITS扩增片段均略大于500bp;RPS0三重PCR对Ca、Ct和Cp DNA扩增,分别得到约310bp、147bp及110bp的片段,与预期结果相符;30株已知假丝酵母菌两步PCR检测结果,种类符合率为100%;43株未知样本两步PCR鉴定结果,经RPS0扩增产物序列测定,符合率亦为100%。结论:建立了ITS通用基因结合RPS0种特异基因鉴定5种常见假丝酵母菌种类的两步PCR技术,该技术简单、快速、准确及廉价;对双重感染患者更有鉴别优势,有临床应用价值。

逆转录巢式PCR扩增AFP基因及肝癌诊断

［目的］探讨外周血甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因分析对肝癌诊断的临床价值。［方法］从人肝癌组织和外周血单核细胞中制 备总ＲＮＡ，经随机引物和逆转录酶合成ｃＤＮＡ后，以巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＡＦＰ基因片段，并分析其在肝癌诊断中的临床 应用价值。［结果］所设计ＲＴ－巢式ＰＣＲ扩增ＡＦＰ基因片段为 １５９ｂｐ，方法的灵敏度为５ｐｇ／ｍｌ。ＡＦＰ基因在肝癌、癌周和远癌组织中 的检出率分别为１００％、６５％和０；在肝癌患者外周血中的阳性率为５３．７％，明显高于其它肝病组和肝外肿瘤组（Ｐ＜０．０１）；在Ｉ、 Ⅱ和Ⅲ期肝癌中阳性率分别为３３．３％、２６．３％和７１．８％，伴肝外转移肝癌中全数阳性，与肿瘤大小无明显相关性。［结论］分析外 周血ＡＦＰ－ｍＲＮＡ有助于肝癌诊断。肝癌转移或术后复发的监测。

横川后殖吸虫与扇棘单睾吸虫双重PCR鉴别方法的建立

目的建立一种能快速鉴定横川后殖吸虫(Metagonimus yokogawai)和扇棘单睾吸虫(Haplorchis taichui)的双重PCR方法。方法从Gen Bank中获取横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫以及与其同源性较高的虫种的核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列,应用Primer premier 5.0软件设计2对特异性引物,并优化PCR反应体系和反应条件,建立双重PCR法。将横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫与17个相关虫种一起进行PCR扩增,检测方法的特异性。横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的ITS1扩增产物经p MD19-T载体进行TA克隆获得质粒,并将质粒进行梯度稀释,检测其敏感性。应用新建的双重PCR法鉴定从47副猫内脏和40副犬内脏中收集的吸虫,检测该方法的准确性和实用性。结果新建的双重PCR法能扩增出横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫的目的片段,大小分别为648 bp和279 bp,不与钩棘单睾吸虫、华支睾吸虫、心形咽口吸虫、次睾属吸虫囊蚴、外睾属吸虫囊蚴、藐小棘隙吸虫、抱茎棘隙吸虫、弗氏棘口吸虫、似锥低颈吸虫、全冠属吸虫、重盘属吸虫、异尖属线虫、东方次睾吸虫、卫氏并殖吸虫、瓦氏瓦生吸虫、背孔属吸虫和宫脂属线虫的DNA发生交叉扩增,具有较好的特异性。敏感性试验表明,应用该双重PCR法,2类吸虫DNA的最低检测值分别为1.49×10-1pg和1.14×10-1pg。对来自猫内脏和犬内脏的吸虫检测表明,该方法能够区分横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫,并且不与猫、狗中其他的吸虫DNA发生交叉扩增。结论本研究所建立的双重PCR法可用于快速鉴定横川后殖吸虫和扇棘单睾吸虫。

HLA-Ⅰ、Ⅱ类PCR-SSP基因分型在肾移植配型及亲子鉴定中的应用

目的 :建立快速、准确的HLA基因分型方法 ,满足临床移植配型的需要。方法 :对 2 1对已进行HLA抗原血清学分型的肾移植的供、受者 ,12例亲子鉴定应用聚合酶链反应 -序列特异引物 (PCR -SSP)进行HLA -Ⅰ、Ⅱ类基因A、B、DRB1、DQB1位点扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并确定其基因型。结果 :基因分型结果与血清学分型一致者有 18对 ,基因分型能明确判断而血清学分型无法判断者有 3对 ;排除亲子关系的有两例。结论 :PCR -SSP方法具有操作简单、快速、结果可靠的特点 ,不仅适用于移植配型、法医学亲子鉴定和个人识别 。

多重PCR技术在鉴定菜豆中的应用

通过分析菜豆及其近缘种共21份植物材料的psbA-trnH基因序列,设计出一对菜豆的特异性引物。将叶绿体trnL和此对特异性引物结合进行多重PCR,结果表明可用于鉴定菜豆。

HLA-Ⅰ、Ⅱ类PCR-SSP基因分型在移植配型及亲子鉴定中的应用

目的：建立快速、准确的ＨＬＡ基因分型方法，满足临床移植配型的需要。方法：对２５对已进行ＨＬＡ抗原血清学分型的骨髓移植的供、受者，１２例亲子鉴定应用聚合酶链反应－序列特异引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）进行ＨＬＡ－Ⅰ、Ⅱ类基因Ａ、Ｂ、ＤＲＢ１、ＤＱＢ１位点扩增，琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ产物并确定其基因型。结果：基因分型结果与血清学分型一致者有２２对，基因分型能明显判断而血清学分型无法判断者有３对；排除亲子关系的有２例。结论：ＰＣＲ－ＳＳＰ方法具有操作简单、快速、结果可靠的特点，不仅适用于移植配型、法医学亲子鉴定和个人识别，也可用于相关疾病及人类遗传学的研究。

鸡致病性大肠杆菌16SrRNAPCR鉴定方法的建立

为了建立一种鸡致病性大肠杆菌的快速检测方法,本试验通过无菌采集疑似感染致病性大肠杆菌鸡的心、肝、脾、肾作为病料,经过细菌分离培养、生化鉴定和致病力试验,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物对3株致病菌进行PCR扩增,均得到了特异性扩增产物。并对扩增产物进行核酸测序和BLAST比对。结果显示,分离得到3株鸡致病性大肠杆菌(DZMG、DGCG1、DGCP3),扩增出的16S rRNA基因序列与鸡致病性大肠杆菌基因序列同源性为100%。提示该检测方法具有特异性高和简单快捷的特点。

食用海藻种属特异性多重PCR鉴定

为了对食用海藻进行种属特异性分子特征鉴定,采用试剂盒提取4种常见的食用海藻(石莼、龙须菜、海带、螺旋藻)样品DNA后,用常规PCR技术进行引物特异性验证,运用双重PCR技术检测引物的灵敏度。结果表明,4种食用海藻(石莼、龙须菜、海带、螺旋藻)得到相应的不同大小单一条带,说明引物具有特异性;在双重PCR体系螺旋藻、石莼以及龙须菜、海带组合,得到石莼的检测限为362 pg,龙须菜的检测限为100 pg。

中间型高温放线菌特异PCR快速鉴别方法的应用

根据中间型高温放线菌的gyrB基因设计了中间型高温放线菌的特异性引物,建立了快速筛选中间型高温放线菌菌种的特异PCR方法,并将其应用于芝麻香型白酒高温大曲中的中间型高温放线菌筛选。结果表明,所设计的特异性引物对中间型高温放线菌具有较高的特异性,可以快速鉴别中间型高温放线菌菌种,并成功从芝麻香型白酒高温大曲中快速筛选获得中间型高温放线菌,与传统的菌种鉴定方法相比,具有高效、灵敏、便捷及成本低廉等显著优点。

运用PCR鉴定异常血红蛋白Q-Thailand

目的 对异常血红蛋白Q-Thailand进行鉴定.方法 首先采用全自动血红蛋白电泳仪进行血红蛋白电泳;其次采用多重断裂点PCR技术（Gap-PCR）检测αα/-α4.2缺失型的α珠蛋白生成障碍性贫血基因型;最后采用扩增不应突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS-PCR）检查α-1珠蛋白基因的Q-Thailand点突变.结果 成功地对3例异常血红蛋白Q-Thailand的携带者进行诊断.结论 运用PCR技术（ARMS-PCR结合Gap-PCR）能够快速鉴定异常血红蛋白Q-Thailand.

以PCR鉴定转基因番茄植株的微量DNA提取方法

微量DNA提取法是目前以PCR法鉴定转基因番茄植株T1代单株幼苗的一种简便、快速、有效的方法.该方法需约1 h即可完成植物DNA的提取,样品用量仅为30-100mg,产量可达30-80μg/g,粗提DNA(溶于10μlTE缓冲液)不必经过纯化,用TE缓冲液稀释5-10倍即可直接用于PCR分析.

PCR法快速检测超市生鲜牛肉卷和腌制牛肉片

通过扩增线粒体DNA片段,建立了检测生鲜牛肉和腌制牛肉片中掺入猪肉的快速检测PCR的方法。反应程序为:94℃预变性4min,然后经过30个循环,每个循环为94℃变性30s,退火温度为59.4℃反应30s,延伸温度72℃反应30s,30个循环后72℃保温延伸7min,通过电泳进行检测。经过多次实验,结果表明:所选定的引物只有在同一种属模板DNA存在的情况下才会发生PCR扩增,该方法特异性强、稳定、灵敏度高。本方法简单快速,无需酶切,适用于样品较多的检测。

接头连接PCR步行法鉴定转基因烟草

应用接头连接PCR步行法,建立了分子水平鉴定不同转基因事件的方法和体系;并利用不同转基因事件外源基因与植物基因组DNA整合位点处核酸序列的差异,设计了不同转基因烟草事件的标签引物,成功地对几个转TMV-CP材料进行了鉴定。