FMDV 3D基因真核表达质粒的构建、表达及对Ⅰ型IFN信号通路的作用

本研究旨在构建口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D基因真核表达质粒,并探究其对Ⅰ型干扰素(interferon,IFN)信号通路的作用。根据GenBank序列合成3D基因并将其插入真核表达载体pXJ41构建真核表达质粒pXJ41-Myc-3D,经PCR、双酶切及测序鉴定正确后分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞,Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测3D蛋白在细胞内的表达及定位。通过双荧光素酶报告基因(Luciferase)、Real-time PCR、TCID50等试验检测HEK-293T细胞中过表达3D蛋白对水疱性口炎病毒(Versicular stomatitis virus,VSV)诱导的Ⅰ型IFN信号通路的影响。结果显示,真核表达质粒pXJ41-Myc-3D构建成功;3D蛋白在HEK-293T细胞中表达,大小约为55 kDa,主要定位在细胞核中;3D蛋白抑制了VSV诱导的IFN-β启动子活性和IFN-β mRNA水平,促进了VSV的复制。本研究为深入探究3D蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路的作用机制奠定了基础。

IFNα-2b治疗323例HBeAg阳性慢性乙型肝炎的效果

目的 探讨IFNα-2b抗病毒治疗乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者的效果。方法回顾性分析2010年1月至2014年1月就诊于南昌大学第二附属医院并接受IFNα-2b治疗的323例HBeAg阳性CHB患者的临床资料,按丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平将其分为3组:ALT<2×ULN(A1组,n=111)、2×ULN≤ALT≤5×ULN(A2组,n=111)以及ALT>5×ULN(A3组,n=101)。观察临床疗效及不良反应,并比较3组间的抗病毒效果。结果 在停药时及停药后第12、24、48、72、96、144、192、240周,323例患者的HBV-DNA阴转率分别为39.9%、40.2%、39.0%、36.2%、34.1%、33.4%、31.3%、30.7%、30.7%;HBsAg阴转率分别为6.2%、6.2%、6.2%、5.9%、5.9%、5.9%、5.6%、5.6%、5.6%;HBeAg血清学转换率分别为28.2%、31.0%、32.8%、34.4%、33.7%、33.1%、32.8%、32.5%、31.6%。在各随访时间点,3组患者的HBV-DNA阴转率和HBeAg血清学转换率比较,A3组显著高于A2组,A2组显著高于A1组(P<0.05);3组患者的HBsAg阴转率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。323例患者均出现发热及类流感样症状,238例(73.7%)出现白细胞及中性粒细胞降低,35例(10.8%)甲状腺功能异常,5例(1.5%)斑秃,1例(0.3%)睡眠障碍,经过密切观察和对症处理后,患者均顺利完成疗程,各指标均基本正常。结论 IFNα-2b治疗HBeAg阳性CHB患者在停药时及停药后随访期间均表现出较好的效果,大多数患者可耐受IFNα-2b的不良反应。IFNα-2b的抗病毒效果可能与ALT水平有关。

化疗联合免疫治疗局部晚期食管癌疗效及对Sil⁃2R、IFN⁃γ、TSGF水平的影响

目的研究化疗联合免疫治疗局部晚期食管癌(LAEC)疗效及对可溶性白细胞介素⁃2受体(Sil⁃2R)、γ⁃干扰素(IFN⁃γ)及恶性肿瘤特异生长因子(TSGF)水平的影响。方法选择2021年3月至2023年7月于中国科学院合肥肿瘤医院治疗的LAEC患者106例,依据随机数字表法将106例患者分为试验组(n=53)、对照组(n=53)。对照组行标准化疗,试验组行化疗联合免疫治疗。观察两组临床疗效、不良反应,比较两组治疗前后血清程序性死亡配体1(PD⁃L1)、程序性死亡受体1(PD⁃1)、Sil⁃2R、IFN⁃γ、TSGF水平。结果试验组客观缓解率(ORR)、疾病控制率(DCR)均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组治疗期间各不良反应分级比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,试验组血清PD⁃L1、PD⁃1及Sil⁃2R、TSGF水平均低于对照组,血清IFN⁃γ水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论化疗联合免疫治疗可有效降低LAEC患者免疫检查点活性,增强机体免疫,可促进产生IFN⁃γ,抑制Sil⁃2R、TSGF生成,疗效较好,且不增加不良反应,具有一定的临床应用价值。

奶牛乳房炎相关IFNE基因的克隆、表达及功能研究

【目的】研究干扰素ε(Interferon epsilon,IFNE)基因在奶牛乳腺上皮细胞(Bovine mammary epithelial cells,bMECs)炎症中的表达模式及其潜在的分子功能。【方法】通过PCR和测序技术得到IFNE基因的编码区(Coding sequence,CDS)序列,并采用生物信息学方法分析IFNE基因及其蛋白质特性;利用RNAi和qPCR技术检测IFNE、干扰素β(Interferon beta,IFNB)、干扰素κ(Inter⁃feronκ,IFNK)、半胱天冬酶3(Cystathione aspartase 3,CASP3)、半胱天冬酶9(Cystathione aspartase 9,CASP9)等基因在脂多糖(Li⁃popolysaccharide,LPS)诱导bMECs炎症反应中的表达量。【结果】IFNE基因的CDS长度为582 bp,可编码由193个氨基酸组成的具有亲水性且不稳定的非分泌蛋白。与对照组(0 h)相比,在LPS诱导3、6、12和24 h的bMECs中白细胞介素⁃6(Interleukin⁃6,IL⁃6)和白细胞介素⁃1β(Interleukin⁃1β,IL⁃1β)的表达量均显著上调(P<0.05,下同),白细胞介素⁃8(Interleukin⁃8,IL⁃8)的表达量极显著上调(P<0.01,下同),表明成功构建了炎症细胞模型。在炎症细胞模型构建成功的基础上,采用qPCR检测bMECs内IFNE基因的表达量结果表明,与对照组(0 h)相比,IFNE基因在LPS诱导bMECs 3、6、12和24 h的表达量均极显著上调,且在诱导6 h的表达量最高。RNAi实验结果表明,干扰IFNE可使得炎症性bMECs内的IL⁃8、IFNB、IFNK和白细胞介素⁃10受体亚基β(Interleu⁃kin⁃10 receptor subunitβ,IL⁃10RB)基因的表达量均显著上调,IL⁃6、IL⁃1β、CASP3、CASP9和BAD基因的表达量均呈极显著上调。【结论】IFNE基因在LPS诱导的bMECs炎症反应中的表达量极显著上调,干扰IFNE基因可通过调控IL⁃6、IL⁃8、IL⁃1β、IFNB、IF⁃NK、CASP3和CASP9等基因的表达而缓解bMECs炎症反应,为奶牛乳房炎的分子治疗和抗乳房炎分子育种奠定理论基础。

PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的疗效及对HBeAg转阴率、免疫功能的影响

目的:分析聚乙二醇干扰素α-2b(PEG-IFNα-2b)联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的效果及对HBeAg转阴率、免疫功能的影响。方法:选取某院2019年3月—2022年3月收治的慢性乙型肝炎患者88例作为研究对象,依据随机抽签法分成研究组与对照组,每组44例。对照组接受替诺福韦治疗,研究组接受PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗,比较2组HBeAg转阴率、HBsAg转阴率、治疗前后肝功能指标[谷氨酰转肽酶(GGT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)]、免疫功能指标(CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、C3、C4)及血清炎性因子[视黄酸受体相关孤核受体(RORγt)、白细胞介素-17(IL-17)、IL-4]水平。结果:研究组HBeAg转阴率、HBsAg转阴率分别为45.45%、13.64%,高于对照组的11.36%、0,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,研究组GGT、AST、ALT、IL-4、IL-17、RORγt分别为(30.42±5.39)U/L、(31.08±6.64)U/L、(29.37±4.68)U/L、(1.32±0.42)pg/mL、(0.64±0.19)pg/mL、(0.80±0.30),均低于对照组的(56.93±8.75)U/L、(38.72±5.83)U/L、(49.61±6.42)U/L、(3.91±1.14)pg/ml、(3.01±0.87)pg/ml、(1.61±0.36),差异有统计学意义(P<0.05)。研究组CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、C3、C4分别为(66.81±8.55)%、(1.53±0.16)、(1.22±0.01)g/L、(0.42±0.07)g/L,均高于对照组的(61.03±8.49)%、(1.26±0.2)、(0.73±0.09)g/L、(0.22±0.06)g/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PEG-IFNα-2b联合替诺福韦治疗慢性乙型肝炎效果明显,可提高HBeAg、HBsAg转阴率,改善肝功能,增强免疫功能,抑制炎性反应。

干扰素刺激基因鸟苷酸结合蛋白2(GBP2)质粒的构建及其抗汉滩病毒感染的作用

目的构建pCMV-GBP2-3tag6真核表达质粒,研究鸟苷酸结合蛋白2(GBP2)在汉滩病毒(HTNV)感染过程中的作用。方法利用一步定向克隆(In-fusion)方法构建pCMV-GBP2-3tag6质粒,并用双酶切和测序方法进行鉴定。将构建成功的pCMV-GBP2-3tag6质粒转染A549细胞,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。A549细胞转染GBP2质粒24 h后感染HTNV。实时定量PCR检测HTNV S、β干扰素(IFN-β)、黏病毒抗性蛋白1(MX1)、干扰素诱导蛋白四肽重复序列1(IFIT1)、CXC趋化因子配体10(CXCL10)基因mRNA表达水平,Western blot法检测GBP2和HTNV核衣壳蛋白(NP)表达,病灶形成实验检测细胞上清中HTNV滴度。结果成功构建pCMV-GBP2-3tag6真核表达质粒,并在A549细胞中成功表达GBP2蛋白;过表达GBP2对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡无影响,但是可以显著降低细胞中HTNV S基因mRNA水平和NP蛋白含量以及细胞上清中HTNV滴度,调控HTNV感染后IFN通路相关基因的表达。结论GBP2可能通过调控IFN的反应抑制HTNV感染。

维生素D、IFN-γ与哮喘的相关性研究进展

维生素D通过遗传与非遗传因素影响哮喘,与哮喘的发生、严重程度、肺功能指标等存在明显的相关性。IFN-γ的升高与哮喘严重程度有关。维生素D可以通过影响IFN-γ的表达从而影响哮喘。该文就维生素D、IFN-γ与哮喘的关系作一综述。

脑心肌炎病毒VP3蛋白抑制I型干扰素信号通路促进病毒体外增殖的研究

天然免疫是抵抗病原微生物感染的第一道防线,为探究病毒蛋白在脑心肌炎病毒感染引起的天然免疫应答过程中的作用机制以及对病毒体外复制的影响,本研究应用分子生物学技术构建结构蛋白VP3的表达载体pCMV-Myc-VP3,转染HEK293细胞后,使其在细胞内过表达;感染病毒后,通过实时荧光定量PCR和TCID50分别检测病毒的基因组拷贝数和病毒滴度,以此验证VP3蛋白表达对EMCV体外增殖的影响;另通过荧光定量PCR检测VP3过表达对EMCV引起的IFN-β和信号通路相关因子mRNA转录水平的影响。结果表明,VP3蛋白可促进EMCV在HEK293细胞内的增殖,初步探索发现VP3蛋白可显著抑制IFN-β的表达。WesternBlot检测发现体外表达VP3后,MAVS蛋白的表达明显减少,但对MDA5表达无影响。试验数据初步表明,VP3蛋白可以通过抑制MAVS的表达拮抗I型IFN信号通路的活化,进而促进病毒增殖。

miRNA146a通过TRAF6下调IFNβ的表达

目的探讨miRNA146a通过TRAF6下调IFNβ的表达情况。方法设计TRAF6基因3’UTR区miRNA146a结合位点的野生型引物,随后预测IRF-3及TRAF6基因3’UTR区域可能的miRNA结合位点,以人cDNA为模板,进行PCR目的片段扩增,将HeLa细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液进行传代培养,并进行细胞RNA提取,逆转录,进行实时定量RT-PCR、免疫印迹实验。结果miRNA146a、miRNA23a、miRNA24k可上调IRF-3启动子活性,通过表达miRNA146a转染细胞检测IFNβ通路上游分子TRAF6、IRAK1、NF-κB,提示miRNA146a、TRAF6、IRAK1、NF-κB均明显下降,表达miRNA146a降低pGL3c-TRAF6-3UTR萤光素酶活性,干扰miRNA146a可上调萤光素酶活性,miRNA146a下调TRAF6表达,TRAF6 siRNA下调PolyI:C激活的IFNβ启动子活性,TRAF6 siRNA较对照能够显著增加miRNA146a对IFNβ启动子下调作用。结论IRF-3及IFNβ可能是EB病毒诱导宿主miRNA的调控靶点,为防治EB病毒相关疾病提供新的思路。

Th1 cells inducing IFNγ response improves immunotherapy efficacy in gastric cancer

Objective: Cancer immunotherapy has made remarkable advances in recent years, but its effectiveness in treating gastric cancer is often limited by the complexity of the tumor microenvironment and the lack of effective biomarkers. This study aimed to identify effective biomarkers for immunotherapy treatment by characterizing the tumor microenvironment.Methods: We retrieved the RNA-seq data from gastric cancer patients treated with the programmed death 1(PD-1) blockade pembrolizumab. Differentially expressed genes associated with clinical outcomes were identified and further analyzed using gene ontology(GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) pathway analysis. Gene signature scores were calculated by single sample Gene Set Enrichment Analysis(ssGSEA). The infiltration levels of immune cells were quantified using the xCell website. Cell type enrichment analysis was performed to compare treatment response and non-response groups, and regression analysis was used to investigate the relationship between interferon gamma(IFNγ) immune response and immune cell infiltration. Biomarkers were identified using least absolute shrinkage and selection operator(LASSO) analysis.Results: Compared to normal tissues, cytokine activity and interleukin-6 production were highly activated in gastric tumors. Responders to pembrolizumab showed significantly up-regulated expression of IFNγ responserelated genes. Cell type enrichment analysis revealed that Th1 cells were significantly enriched in the tumor microenvironment of responders. Regression analysis indicated that Th1 cells induced IFNγ response more efficiently than other cell types. Using signatures of Th1 cells, stromal cells and IFNγ response, a set of eight genes were identified that effectively predicted the efficacy of immunotherapy treatment and patient prognosis.Conclusions: Th1 cells promote therapeutic efficacy of PD-1 blockade by promoting IFNγ immune response in gastric cancer. The identified biomarkers have the potential to improve the effectiveness of immunotherapy treatment for gastric cancer patients.

上皮IFNγ信号传导和区室化抗原呈递协调肠道免疫

所有有核细胞均表达主要组织相容性复合物I和干扰素-γ(IFNγ)受体,但上皮细胞所具有的IFNγ信号传导或通过主要组织相容性复合物I进行抗原呈递的特异性功能尚未被探索。研究人员发现,在感应IFNγ时,结肠上皮细胞有效地将病原体和自身衍生的抗原呈递给同源的上皮内T细胞,这些T细胞位于上皮屏障的关键位置。上皮细胞的抗原呈递赋予同源的上皮内T细胞ATP酶的胞外表达,这限制了胞外三磷酸腺苷的积累以及随后组织巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活。相比之下,组织巨噬细胞的抗原呈递以及炎性小体相关的白细胞介素-1α和白细胞介素-1β的产生,促进了CD4+T细胞在体内向产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的T细胞的致病性转化,从而促进结肠炎和结直肠癌。综上所述,该研究揭示了需要上皮细胞进行IFNγ感应和抗原呈递的关键检查点,这些检查点控制体内致病性CD4+T细胞反应的发展。

北京鸭Ⅰ型干扰素基因分子克隆与序列分析

为了进行北京鸭重组干扰素 (IFN)类生物制剂的研究 ,根据现有鸭Ⅰ型IFN基因设计了引物对 ,用PCR法克隆了我国标准品种北京鸭IFN基因 ,定名为BDIFN α。BDIFN α开放框架 (ORF)由 576个核苷酸构成、编码 191个氨基酸。BDIFN α与鸭 1型IFN基因核苷酸间同源性为 99 8% ,在 390位存在点变异 ,但在氨基酸水平完全一致。BDIFN α氨基酸与鸡Ⅰ型IFN同源性在 50 5%～ 51% ,与狗、猪等哺乳类Ⅰ型和Ⅱ型IFN比较同源性低于 39%。结果揭示了BDIFN

惠阳胡须鸡IFN-α基因克隆和序列分析

根据红色原鸡IFN A基因设计了引物对 ,采用PCR法克隆并测序了我国地方标准品种惠阳胡须鸡的IFN α基因 ,定名为HyIFNA4。HyIFNA4与红色原鸡类IFN α比较 ,ORF长度均为 582个核苷酸、编码 162个氨基酸 ,相互间同源性在 97 4 %～ 99%。

IFNγ 防治大鼠胆总管结扎所致肝纤维化的实验研究

目的：了解ＩＦＮγ对持续肝外性淤胆所致肝纤维化的作用。方法：制作大鼠持续肝外性淤胆模型，用药组于胆管结扎同时每日肌注ＩＦＮγ５×１０４Ｕ，用药２周；对照组则仅行胆管结扎而不用药。２周后分别测定血清生化指标、肝纤维化指标及肝能量代谢有关指标。结果：ＩＦＮγ可改善血清生化指标（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５）。在组织学表现上，用药组肝纤维化程度显著低于单纯结扎组（Ｐ＜０．０１）。用药组大鼠淤胆后肝羟脯氨酸及血清透明质酸水平升高明显受抑（Ｐ＜０．０１）。肝ＡＴＰ及ＣＰ测定显示淤胆合并用药时两者均保持于较高水平。

细菌内毒素对鸡NLRC5受体及IFN基因转录的影响

本研究旨在探讨鸡NLRC5受体及IFN基因对不同细菌内毒素的诱导表达变化,为禽类NLRC5受体的分子功能及其参与先天免疫调控的作用机制提供理论依据。用不同浓度的(0、0.1、1.0、10.0μg.mL-1)来自致病性大肠杆菌(E.coli,EC)和肠炎沙门氏菌(S.enteriditis,SE)的2种内毒素(LPS)分别刺激鸡天然巨噬细胞系(HD11)2、4和6h,在不同的时间点收集细胞,提取总RNA,并设计相关引物,利用荧光定量PCR分析鸡NLRC5受体以及下游功能基因IFNA和IFNB的转录量变化,探讨HD11细胞对不同来源的细菌内毒素的免疫反应。研究表明:与对照组相比,1.0和10.0μg.mL-1的EC-LPS、SE-LPS均能诱导HD11细胞产生免疫应答,但0.1μg.mL-1组未能诱导成功;不同细菌LPS诱导的免疫应答时间不一致,经EC-LPS诱导的NLRC5和IFNB基因均在刺激后6h达到转录高峰,与2、4h差异显著(P<0.05),与对照组差异极显著(P<0.01);但IFNA基因在2、6h达到高峰,而在4h下降,呈"V"型转录趋势。SE-LPS诱导的NLRC5和IFNA、IFNB转录量随时间均保持一直上升的趋势,在6h达到高峰,且与对照组及2、4h差异显著(P<0.05)。结果表明NLRC5受体与IFNA和IFNB共同参与了细胞对细菌内毒素的免疫应答,NLRC5基因可能对鸡先天免疫功能具有调节作用。

猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

巴斯德毕赤酵母载体质粒 pPICZαA含有强启动子 PAOXⅠ和α MF信号肽序列,构建猪 IFNα基因的重组质粒pPICZαA IFNα,并转入E .coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪 IFNα基因。通过电击将经 SacⅠ酶切后线性化的 pPICZαA IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母 KM71中。SDS PAGE和Western blot鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的猪 IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原 抗体反应,表达量为 0.45 mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.1×104 IU/mL。

当归多糖组分AP-3诱生小鼠脾细胞IL-2和IFN-γ的作用

目的研究当归多糖组分AP-3对细胞因子IL-2和IFN—γ的诱生作用，以探讨其免疫调节的特点。方法流式细胞术测定培养的脾细胞中Cd4^＋细胞比例；酶联免疫法测定培养上清液中IL-2和IFN-γ的浓度；RT—PCR法测定IL-2和IFN-γ mRNA的转录水平。结果AP-3在0．6～2μmol·L^-1，能显著提高培养脾细胞CD^4＋细胞的百分率；在2～6μmol·L^-1，AP-3时间、剂量依赖性地增加培养的细胞上清液中IL-2的浓度和细胞内IL-2 mRNA的转录水平，而对于IFN-γ和IFN-7 mRNA，则先升高后降低，并呈现剂量依赖性。结论当归多糖能够促进IL-2和IFN-γ的分泌，激活Th1细胞，从而发挥免疫调节作用。

Th1/Th2细胞因子处理的树突状细胞在过敏性气道炎症中作用

目的探讨Th1/Th2细胞因子IL-4或IFNγ对树突状细胞生物学性状的影响以及经IL-4或IFNγ处理后的树突状细胞在过敏性气道炎症中的作用。方法体外扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞,采用流式细胞术检测IL-4或IFNγ对树突状细胞表型的影响以及观察IL-4或IFNγ处理的树突状细胞对T细胞的作用;观察IL-4或IFNγ处理的树突状细胞过继卵蛋白致敏小鼠肺组织病理特点和支气管肺泡灌洗液细胞类型。结果IL-4或IFNγ处理的树突状细胞表达CD80和MHCⅡ均明显增加并呈剂量依赖性;IL-4处理的树突状细胞显著增加T细胞分泌IL-4,而IFNγ处理的树突状细胞显著增加T细胞分泌IL-4和IFNγ;IL-4或IFNγ处理的树突状细胞过继小鼠肺组织可见典型的过敏性气道炎症改变,支气管肺泡灌洗液细胞类型与哮喘组无显著差异。结论IL-4活化的树突状细胞诱导Th2免疫反应,IFNγ活化的树突状细胞诱导Th1和Th2免疫反应,而且IFNγ并未改善过敏性气道炎症。

乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗研究进展

慢性乙肝病毒感染是全世界主要的公共卫生问题之一,每年有约3%的慢性乙型肝炎患者发展为肝硬化。若无有效的抗病毒治疗手段,这些乙肝患者会发展为失代偿期肝硬化或肝细胞癌。对于肝硬化患者,干扰素(interferon,IFN)和核苷类似物[nucleos(t)ide analogues,NUCs]是重要的抗病毒药物。IFN能抑制乙肝病毒复制并调节免疫功能,但不良反应较大,仅可用于情况较好的代偿期肝硬化患者;NUCs包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定及替诺福韦酯,能够抑制病毒复制,减少肝硬化患者远期并发症的发生,不良反应小但容易发生病毒耐药。本文对乙肝肝硬化的抗病毒治疗新进展作一综述。