CTLA4Ig基因转染猪皮敷料对患儿Ⅱ度烧伤炎症反应的影响

目的:观察人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因转染猪皮敷料在患儿Ⅱ度烧伤治疗中对炎症反应的影响。方法:抽取我院基因转染猪皮治疗急性烧伤的患儿40例作为观察组,银离子敷料治疗烧伤的患儿40例作为对照组。对比两组烧伤患儿的住院时长、发热天数,以及治疗前后的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、C-反应蛋白(CRP)、血清降钙素原(PCT)4种炎症指标的表达水平。结果:基因转染猪皮观察组患儿住院时间为(15.23±5.58)d,短于对照组的(18.85±11.47)d。观察组患儿发热天数为(3.60±2.35)d,少于对照组(P<0.05)。观察组患儿治疗后的WBC、CRP、PCT水平均低于对照组,且降低幅度均高于对照组(P<0.05)。结论:CTLA4Ig基因转染猪皮敷料治疗小儿Ⅱ度烧伤创面具有缩短发热时间、降低炎症反应的优点。

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况 ,同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染 7d后大鼠、小鼠血清中出现CTLA4Ig ,持续表达 2周。各动物未见异常死亡 ,各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠。

上皮性恶性肿瘤细胞的Ig基因分析

目前的免疫学理论认为,Ig基因的重排只存在于B淋巴细胞的发育过程中,机体的其他正常细胞则不会有该事件的发生.我们在工作中发现乳腺癌、大肠癌等某些上皮性恶性肿瘤内存在与IgG抗原性相同、分子量相近的Ig样蛋白.为了探讨这种物质是否是Ig及其来源,我们对部分肿瘤细胞的Ig基因结构进行了分析.

靶向融合防龋DNA疫苗研究(Ⅱ)—编码人Ig基因的质粒pJIg的构建

目的 :构建编码人免疫球蛋白Igγ1铰链区和恒定区基因的质粒pJIg ,为进一步研制靶向融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :从人外周淋巴细胞中获得细胞总RNA并合成cDNA第一链 ,利用半巢式PCR扩增Igγ1恒定区序列 ,进行T -A克隆 ,构建 pJIg质粒 ,酶切电泳 ,并测序鉴定。 结果 :RT -PCR获得了目的基因 ,质粒 pJIg携带有Igγ1目的片段基因。 结论 :成功构建编码人免疫球蛋白Igγ1恒定区基因的质粒 pJIg。

流式细胞术结合Ig基因重排在B细胞淋巴瘤细针穿刺标本诊断中的应用

目的探讨流式细胞术(flow cytometry,FCM)结合PCR检测Ig基因重排在B细胞淋巴瘤(B-celllymphoma,B-NHL)细针穿刺小标本诊断中的应用价值。方法对经组织学确诊的36例B-NHL和28例反应性增生的浅表淋巴结肿大病例行细针穿刺,对其组织学形态、免疫组化染色、FCM免疫表型及细胞学形态进行回顾性分析,并采用BIOMED-2系统引物分析Ig基因重排情况,总结B-NHL各亚型的FCM免疫表型特点及细胞学特点,以及对比分析FCM与Ig基因重排联合诊断与组织学诊断之间的符合率。结果 36例组织学诊断的B-NHL中,31例经FCM/Ig基因重排可确诊(符合率为86.1%),23例可以区分亚型(符合率为63.9%)。28例组织学诊断的反应性增生中,27例经FCM/Ig基因重排可确诊(符合率为96.4%)。结论 FCM免疫表型联合Ig基因重排在对B-NHL诊断和分型方面有较高的应用价值,尤其适用于细针穿刺小标本,但对富于T细胞性大B-NHL和淋巴瘤结内非弥漫性病变的病例诊断意义不大。

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CT-LA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30kb和4.5kb2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.

CTLA4Ig基因转染对大鼠胰岛移植的影响

目的 研究CTLA4Ig基因在糖尿病大鼠体内表达及其产物延长胰岛移植物存活的作用。方法 利用Lipofectin载体包裹CTLA4IgcDNA质粒后转染鼠胰岛和肌肉细胞 ,检测移植后CTLA4Ig基因表达水平 ,观察CTLA4Ig基因表达在延长糖尿病鼠胰岛移植物和大鼠存活时间的作用。结果 A组胰岛移植第 7天 2只大鼠血清CTLA4Ig呈阳性 (阳性率 2 0 % ) ,分别为 14ng ml和 31ng ml。B组胰岛移植后维持血糖正常时间平均 (3 .6± 5 .1)d ,A组胰岛移植后维持血糖正常平均 (14 .8± 12 .3)d ,两组比较差异显著 (P <0 .0 5 )。A组大鼠平均存活 (2 4.0± 10 .8)d ,最长 45d ,B组大鼠平均存活 (10 .8± 4.8)d ,最长 2 1d ,两组大鼠生存时间差异非常显著 (P <0 .0 1)。结论 CTLA4Ig基因可以在受体大鼠胰岛细胞或肌肉组织表达 。

腺病毒介导的CD40Ig基因治疗诱导异基因大鼠心脏移植物的长期存活

目的:通过腺病毒介导的CD40Ig基因治疗,阻断受体体内CD40/CD154共刺激途径,诱导异基因大鼠之间的心脏移植耐受,并探讨相关机制。在将异基因DA大鼠的心脏移植给受体LEW大鼠后,即经门静脉输注携带CD40Ig基因的腺病毒(AdCD40Ig,5×109 pfu)。观察、记录心脏移植物的存活时间。ELISA检测受体大鼠体内CD40Ig蛋白的表达。通过MLR,IL-2逆转实验及Th1/Th2型细胞因子表达的检测,研究耐受的机制。结果:与未处理对照组相比,携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒(AdEGFP)给予组,移植物的存活时间未见明显延长;AdCD40Ig腺病毒给予组,异基因大鼠心脏移植物平均存活时间延长至(142.8±26.8)天。ELISA检测表明,CD40Ig蛋白在受体体内表达时间较长,但随时间的推移表达水平逐渐下降。Th1和Th2型细胞因子的检测结果显示,耐受大鼠体内未发现这两类细胞因子偏移的现象。MLR证明耐受大鼠对供体抗原表现为特异性低应答。IL-2逆转实验表明,该耐受形成的早期与克隆无能有关。结论:经.AdCD40Ig腺病毒基因治疗的受体大鼠可以产生特异性的移植耐受,使异基因大鼠心脏移植物长期存活。

儿童急性B淋巴细胞白血病中相关融合基因检测结合BIOMED-2标准化Ig基因重排的应用研究

目的:探讨ALL相关基因检测与BIOMED-2标准化Ig基因重排技术在儿童B-ALL诊治中的应用以及两者的之间的相关性。方法:采用ALL相关基因检测试剂盒与BIOMED-2系统引物,分别进行RNA/DNA的多重PCR扩增,并应用RQ-PCR进行荧光检测及PCR片段分析法进行Ig基因重排的克隆性分析。结果:251例B-ALL患儿中TEL-AML1^+77例,E2A-PBX1^+28例,MLL-AF4^+10例,BCR-ABL^+11例,总阳性率为50.2%;IgH V_H-J_H重排阳性率为82.5%,IgK重排阳性率为53.4%。融合基因与基因重排的联合检出率为99%。E2A-PBX1^+组及MLL-AF4^+组中Ig H及Ig K分别与阴性对照组相比,其中Ig K阳性率的差异具有统计学意义(P<0.001及P=0.005)。对105例融合基因阳性患者同时检测染色体荧光原位杂交,其阳性符合率均大于94%。结论:ALL相关融合基因筛查与BIOM ED-2标准化Ig基因重排技术相结合,不仅可以大大提高在儿童B-ALL的检出率,还可以对疾病预后进行较为精确地分组,同时相对于染色体FISH检测更加快速灵敏。

含CTLA4Ig基因的逆转录病毒感染人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的制备含CTLA4Ig基因的逆转录病毒包装细胞并感染人骨髓间充质干细胞(MSCs),为后续实验作准备。方法采用Percoll密度梯度离心分离人骨髓MSCs。用含有CTLA4Ig基因的逆病毒感染第1代人骨髓MSCs,应用G418筛选出抗性细胞群(MSCs-C),应用RT-PCR检测其CTLA4IgmRNA表达,免疫细胞化学检测其CTLA4Ig蛋白质表达。结果Percoll(1.073g/mL)分离培养的第3代MSCs94.59%CD105表达阳性,97.58%CD34表达阴性。转染细胞(MSCs-C)RT-PCR证明CTLA4Ig基因被成功导入MSCs中并转录;免疫细胞化学结果显示绝大多数MSCs-C细胞表达CTLA4Ig蛋白,其表达于细胞浆中。结论CTLA4Ig基因可以通过逆转录病毒成功导入人骨髓MSCs中,这种基因修饰的细胞可以表达目的基因及目的蛋白,可能通过目的蛋白的分泌达到降低免疫原性和增强免疫抑制的作用。

CTLA4Ig局部转基因对小肠移植急性排斥的治疗作用

目的:研究CTLA4Ig基因在移植小肠局部表达及其表达产物对急性排斥反应的治疗作用. 方法:建立SD→Wistar的大鼠异位小肠移植模型,并随机分为实验组(CTLA4Ig转基因组)和对照组(非转基因组). 实验组供肠移植前经肠系膜上动脉注入脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA,术后应用免疫组织学检查移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达.移植术后3,7,10 d分别获取各组的移植小肠进行组织学检查及细胞凋亡测定. 结果:经CTLA4Ig cDNA处理的小肠在移植术后可见大量的CTLA4Ig表达.对照组移植肠在术后7,10 d分别出现I, Ⅱ度急性排斥反应,同时凋亡细胞数量显著增加.实验组移植肠术后未见排斥反应的病理学证据,凋亡细胞偶见. 结论:CTLA4Ig基因可在移植小肠局部转染表达,其表达产物可防止移植术后急性排斥反应的发生.

恶性淋巴瘤诊断中Ig/TCR基因重排的分子病理检测分析

目的探讨B细胞性淋巴瘤中Ig基因重排和T细胞性淋巴瘤中TCR基因重排的特点。方法回顾性分析213例恶性淋巴瘤和24例淋巴反应性增生组织样本,利用3730毛细血管电泳对提取的DNA进行PCR扩增,检测B细胞性淋巴瘤中Ig基因重排和T细胞性淋巴瘤中TCR基因重排。结果 B细胞性淋巴瘤中IgHA的总阳性率为43.21%,IgHB的总阳性率为29.63%,IgHC的总阳性率为30.25%,IgHD的总阳性率为16.67%,IgHE的总阳性率为3.09%,IgLκA的总阳性率为42.59%,IgLκB的总阳性率为23.46%,IgLλA的总阳性率为25.93%,IgH(A+B+C+D+E)+IgLκ(A+B)+IgLλA的总阳性率为88.27%;T细胞性淋巴瘤中TCRB-A的总阳性率为31.37%,TCRB-B的总阳性率为58.82%,TCRB-C的总阳性率为23.53%,TCRG-A的总阳性率为60.78%,TCRG-B的总阳性率为21.57%,TCRD的总阳性率为29.41%,TCRβ+TCRγ+TCRδ的总阳性率为78.43%。结论Ig基因重排和TCR基因重排分别对B细胞性和T细胞性淋巴瘤的诊断具有重要价值。

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。

移植物局部转染CTLA4Ig基因对大鼠小肠移植排斥反应的预防作用

目的探讨CTLA4Ig基因在移植小肠局部转染表达及表达产物对排斥反应的预防作用。方法大鼠小肠移植前,经肠系膜上动脉给供肠灌注脂质体包裹的CTLA4IgcDNA重组质粒,术后应用组织免疫学及逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达,并行组织病理学检查,同时设立无CTLA4Ig基因转染的对照组。结果对照组(n=8)的移植小肠在术后7～14d全部坏死;实验组(n=18)7只受鼠的移植小肠于术后56～90d坏死,11只受鼠的移植小肠于术后90d时仍存活良好。对照组移植物组织切片见单核细胞广泛浸润,肠壁肌层及黏膜出血坏死,绒毛及隐窝结构消失;实验组存活超过90d者组织切片仅见少量单核细胞浸润,黏膜轻度增厚,但无明显的肠绒毛缩短及隐窝细胞减少等改变。组织免疫学及RTPCR结果显示,在移植后28d内移植小肠中有CTLA4Ig转基因产物的表达,但第56d及90d则检测不到其表达。结论经肠系膜上动脉体外灌注脂质体包裹的CTLA4IgcDNA重组质粒可有效转染移植小肠,CTLA4Ig基因在移植小肠局部转染对术后的排斥反应具有预防作用。

携带小鼠CD40Ig基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建携带小鼠CD4 0Ig基因的重组腺病毒载体 ,为研究供体特异性移植耐受诱导做准备。方法分别克隆小鼠CD4 0胞外区cDNA和IgG2a Fc段cDNA ,以PCR方法将二者连接为CD4 0Ig。再将后者装入腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV ,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5 183中同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带CD4 0Ig的重组腺病毒AdCD4 0Ig。 结果成功构建携带CD4 0Ig的重组腺病毒载体系统 ,病毒滴度为 5× 10 9efu/ml。结论构建的AdCD4 0Ig可用于供体特异性移植耐受的实验研究。