IHFB蛋白全人源单克隆抗体制备及对铜绿假单胞菌生物被膜形成影响的研究

目的探讨靶向铜绿假单胞菌IHFB蛋白的单克隆抗体对细菌生物被膜形成的影响。方法以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板,利用PCR技术扩增Ihfb基因,进一步构建重组表达载体p ET28a-Ihfb,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达IHFB蛋白,经Ni2+亲和树脂纯化获得IHFB蛋白;利用噬菌体抗体库技术筛选获得与IHFB蛋白特异性结合的全人源单克隆抗体,PCR扩增所获得抗体的重链VH和轻链VL基因并构建重组表达载体,继而转染至293E细胞中,收集胞外分泌蛋白,并利用Protein A树脂纯化单克隆抗体。利用ELISA实验检测抗体亲和力,利用铜绿假单胞菌生物被膜形成实验检测抗体活性。结果与结论通过噬菌体展示技术筛选并获得了全人源抗IHFB单克隆抗体,命名为YG15; ELISA结果表明,YG15抗体与IHFB蛋白有较高亲和力(EC50为24. 8 ng/ml),实验结果验证全人源单克隆抗体YG15可抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。

霍乱弧菌宿主整合因子β亚单位的可溶性克隆表达

目的克隆表达霍乱弧菌全局性调节子宿主整合因子(integration host factor,IHF)β亚单位基因ihfB。方法以C7258染色体为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增ihfB基因,扩增产物经NheⅠ和SapⅠ酶切后克隆入表达载体p XTB1;将ihfB的N端和α亚单位基因ihf A的C端通过搭桥PCR重组,重组片段N-ihfB-C-ihf A经NheⅠ和SapⅠ双酶切后克隆入表达载体p XTB1。重组质粒导入大肠埃希菌ER2566,0.4 mmol/L IPTG诱导表达,超声裂解,上清经CBD柱吸附纯化,二硫苏糖醇(DTT)柱上裂解洗脱。结果成功构建表达野生型ihfB基因和嵌合体N-ihfB-C-ihf A的重组表达质粒p XTB1-ihfB和p XTB1-N-ihfB-C-ihf A,并在宿主菌ER2566中诱导表达。p XTB1-ihfB为不溶性的包涵体表达,p XTB1-N-ihfB-C-ihf A为可溶性表达,并获得高纯度的表达产物。结论克隆表达了IHFβ亚单位基因ihfB,IHF-α的C端可显著提高IHF-β的可溶性,获得可溶性表达的纯化IHF-β嵌合体蛋白,为后续调控功能研究奠定了基础。