全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术在重组蛋白疫苗电荷异质性分析中的应用

重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键。重组蛋白疫苗与治疗性蛋白制品一样,因体外合成和纯化过程的复杂性而表现出异质性。其中,电荷异质性是重组蛋白质的关键质量属性之一。电荷异质性监测有助于推动生产工艺的优化,反映产品生产的一致性和稳定性等,对保证重组蛋白产品的安全和质量至关重要。开发可靠快速、灵敏稳健的电荷异质性分析方法一直是生物制药行业所追求的目标。经典的电荷异质性分析方法主要有离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)以及全柱成像毛细管等电聚焦电泳(WCID-CIEF)等,其中WCID-CIEF提供的等电点(pI)和峰形的生化指纹有助于对疫苗多蛋白成分的分析。基于以上该文将对WCID-CIEF的原理和特点及其在重组蛋白疫苗质量控制中的应用进行概述。

毛细管等电聚焦/毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建

设计并制作了一种新型的中空纤维接口 ,以此为核心构建了毛细管等电聚焦 (CIEF) /毛细管无胶筛分 (CNGE)电泳二维蛋白质分离技术平台 ,实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中。利用该二维分离平台 ,对血红蛋白样品进行了高效、快速分离分析 ,验证了该二维分离平台的可行性及分离效能。实验结果表明 :二维分离系统总的峰个数和分离效能都比各自一维分离系统有较大提高。

毛细管等电聚焦电泳技术进展

介绍了毛细管等电聚焦电泳(CIEF)技术的发展和现状,特别对载体两性电解质、柱内表面处理和检测技术等方面的最新进展加以系统评述,并且对CIEF的定性能力、峰容量、重现性及其在生命科学方面的应用前景进行了讨论。引用文献59篇。

毛细管电泳-电喷雾质谱联用技术及其在蛋白质分析领域中的应用

综述了毛细管电泳与电喷雾质谱联用的接口技术、分离模式及其在蛋白质分析领域中的应用 。

毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维蛋白质分离平台的构建及其性能

A two-dimensional separation platform of capillary isoelectric focusing(CIEF)-capillary zone electrophoresis(CZE) for proteins was constructed by a microdialysis hollow fiber interface. The interface provided ease of fabrication,speed of mass delivering and convenience of column switching. Chrome c was selected to demonstrate the 2D separation systems feasibility and resolving performance. The 2D separation system was found to greatly increase the resolving power and overall peak capacity over those obtained for either dimension alone.

高效毛细管电泳技术

介绍了新型分离分析技术高效毛细管电泳的进展，包括基本理论、仪器工作原理、进样方法及各种分离模式，并讨论了这一新技术的特点以及在药物分析方面的应用与前景。

基于CIEF的全柱成像检测在生命分析中的应用

全柱成像检测(whole column imaging detection,WCID)是近年来发展起来的新型检测技术.它与毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,CIEF)的联用取得了很大的成功.CIEF-WCID联用技术综合了CIEF的高分辨和WCID的可提供更多信息的优势,已广泛应用在生物分子的分析和蛋白质与其配体相互作用的研究中.

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析蛋白质药物电荷异质性

评价了cIEF-WCID检测多肽与蛋白质药物等电点的应用效果。测定标准多肽的等电点,验证了cIEF-WCID具有高的准确度和良好的重复性(相对标准偏差<0.50%)。人血红蛋白的4种主要异构体实现了基线分离;甘赖胰岛素的重复测试均只检出单一特征峰(p I 5.95±0.01);比较重组人生长激素原液和成品,等电点特征峰比例差异明显,且成品有新特征峰出现;对比进口及国产贝伐单抗,发现厂家1、3与原研药基本一致,厂家1的主成分迁移规律与原研药高度一致,厂家2的重链C末端K缺失、N末端焦谷氨酸环化或脱酰胺修饰影响了电荷异质性;通过考察尿素浓度、电解质范围和聚焦时间,优化了检测重组人促卵泡素等电点条件:2 mol/L尿素,两性电解质pH 2.5~5.0与pH 3.0~10.0按1∶1混合,聚焦电压1 000 V(1 min)~1 800 V(4 min)~2 200 V(1 min)。cIEF-WCID可快速、准确测定具有电荷异质性的蛋白类药物等电点,分辨率和重复性好,尤其是可以跟踪聚焦过程中样本的迁移特征,特别适合蛋白类药物复杂电荷异质性的检测。

毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用

单克隆抗体药物在生物制药行业占有重要地位,是生物医药领域发展的主要方向。因此,单克隆抗体药物的质量控制已成为全球生物制药企业及法规机构关注的热点,对单克隆抗体药物精确表征的需求日益增加。毛细管电泳技术具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、样品用量少等特点,已成为单克隆抗体药物分析和质量控制的重要手段。该文对毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳等模式在单克隆抗体药物的纯度分析、等电点测定、电荷异质性分析和N-寡糖分析的应用进行综述,以期为国内单克隆抗体研究开发和生产的企事业单位提供技术参考。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳测定艾塞那肽等电点

目的:采用新一代全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术(CIEF-WCID)测定艾塞那肽等电点。方法:采用互补性金属氧化物半导体成像技术对样品等电聚焦过程进行实时记录,根据适宜的marker计算得到艾塞那肽的等电点,并对方法的准确度与重复性进行考察。结果:测得艾塞那肽等电点为5.46,与凝胶电泳结果基本一致,相对标准偏差为0.11%。CIEF-WCID方法快速准确,相对误差小于2.5%,重复性良好。结论:CIEF-WCID作为一种新的技术手段可用于艾塞那肽等电点的分析,方法快速、准确、重复性好,可为多肽的质量控制提供一种可靠的分析方法。

垂直板等电聚焦法测定基因重组人红细胞生成素(rhEPO)各异构体组分含量

建立了测定基因重组人红细胞生成素(rhEPO)各异构体组分含量的垂直板等电聚焦方法,该方法经济,测定结果准确、可靠,与《欧洲药典》6.0版规定的毛细管区带电泳法的测定结果基本一致,本法为rhEPO生产过程控制及原液质量控制提供了准确、可行的检测手段。

基于双特异性抗体的全柱成像毛细管等电聚焦电泳方法开发策略

双特异性抗体是治疗性抗体领域的研究热点,抗体药物的质量控制也一直是生物制药企业和法规机构的关注重点。全柱成像毛细管等电聚焦电泳(Whole-Column Imaging Detection for Capillary Isoelectric Focusing,WCID-CIEF)是检测治疗性双特异性抗体等电点(Isoelectric point,p I)与电荷异质体的有效方法,但由于双特异性抗体分子本身的结构与理化性质复杂,通常需要针对特定分子进行方法开发或优化,以保证分析方法的专属性和良好的分离效果。本文基于双特异性抗体对全柱成像毛细管等电聚焦电泳的方法开发策略进行概述,包括添加剂、载体两性电解质种类与比例、占位剂、上样量、等电点标记物以及工作溶液稳定性等方面,以期为国内双特异性抗体研究与生产提供方法开发上的技术参考。

百日咳黏附素等电点全柱成像毛细管等电聚焦电泳检测方法的建立及验证

目的 建立百日咳黏附素(pertactin,PRN)等电点(isoelectric point,pI)全柱成像毛细管等电聚焦电泳(whole column imaging detection-capillary isoelectric focusing,WCID-CIEF)检测方法,并进行验证。方法 通过优化检测PRN抗原WCID-CIEF过程中的聚焦时间、样品终浓度等参数,建立测定PRN抗原的WCID-CIEF方法,并对方法进行专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性验证。结果 PRN抗原pI WCID-CIEF测定方法的最佳聚焦时间为1 500 V预聚焦1 min,3 000 V聚焦3 min;体系中PRN抗原最佳终浓度为300μg/mL。PRN抗原pI约为6.035,样品缓冲液在抗原各峰位置无干扰峰,方法的专属性、准确性、重复性、中间精密度、耐用性及批间一致性均良好。结论 建立的WCID-CIEF方法适用于PRN抗原的pI检测及电荷异质性分析,可为PRN抗原的表征提供依据以及相关疫苗研发和生产过程中的质量控制提供参考。

全柱成像毛细管等电聚焦(iCIEF)技术分析重组人IgG VEGFR:Fc-融合蛋白电荷异质性

目的:建立全柱成像毛细管等电聚焦法(iCIEF)分析重组人IgG VEGFR:Fc-融合蛋白(血管内皮生长因子受体-抗体Fc融合蛋白)的电荷异质性。方法:首先对全柱成像毛细管等电聚焦方法在蛋白浓度、助溶剂、两性电解质、聚焦时间等方面进行了条件优化。并应用优化的方法进行Fc-融合蛋白的电荷异质性及等电点检测及重复性验证,并将结果与毛细管等电聚焦(cIEF)及平板胶等电聚焦(IEF)结果进行对比分析。结果:在优化的实验条件下,分析Fc-融合蛋白的电荷异质性及等电点具有良好的分离度和重复性,分离效果明显好于cIEF和IEF,且主成分的pI重复测定RSD均小于0.5%。结论:iCIEF作为一种新的技术手段,用于重组蛋白类药物电荷异质性及等电点分析,方法快速、准确,重复性好,能够较好地检测高度糖基化的重组VEGFR:Fc-融合蛋白产品的电荷异质性,为保障Fc-融合蛋白类产品生产工艺的稳定性及质量控制提供了一种快速、可靠的分析方法。

重组双特异性抗体药物电荷异质性分析iCIEF方法新载体基质研究及验证

目的:建立应用成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)法测定重组双特异性抗体(bsAb)电荷异质性的新载体基质的方法。方法:首先,对2种bsAbs在传统的载体基质甲基纤维素(MC)/羟丙甲基纤维素(HPMC)与新的甘油基质中的电荷异构体分离效果进行对比;然后,对甘油基质方法进行进一步优化,以研究甘油浓度、两性电解质种类及其终浓度、不同pH范围两性电解质的组合方式等对电荷异构体分离效果的影响,获得基于甘油基质最佳的分析条件;最后,应用甘油基质的最优分离条件进行了iCIEF方法验证,包括精密度、准确度、线性范围及稳定性指示性验证等。结果:2种bsAbs在甘油基质中的电荷异构体的分离效果均优于HPMC载体基质,且方法的稳健性较好;方法验证结果显示:对于bsAb 1,酸区、主峰、碱区峰峰面积百分比的RSD均小于2.0%,精密度良好;在蛋白终浓度0.10~0.30 mg·mL^(-1)范围内,主峰平均峰面积与蛋白浓度回归曲线r大于0.99,线性良好;每个浓度点的回收率均在95%~105%范围内,准确度良好。对于bsAb 2,酸区、主峰峰面积百分比RSD均小于2.0%,碱区峰面积百分比小于20.0%,精密度良好。该方法能够指示出产品电荷异构体的含量变化情况,可用于产品的质控。结论:使用甘油作为新的载体基质代替传统的HPMC载体基质进行iCIEF分析,具有分离度较好,稳定性强,准确性高,成本低等优势,解决了结构较复杂的重组双特异性抗体类药物在传统MC/HPMC载体基质中无法实现电荷异构体良好分离的难题,尤其适用于复杂的双特异抗体类药物的产品质量评估及质量控制。

重组人脑利钠肽等电点分析全柱成像毛细管等电聚焦电泳法的建立及验证

目的建立重组人脑利钠肽等电点(isoelectric point,pI)分析的全柱成像毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection,CIEF-WCID)法,并进行验证。方法采用CIEF-WCID法对两性电解质、占位剂、蛋白浓度、聚焦时间等进行优化后,获得检测重组人脑利钠肽的最佳检测条件。对建立的方法进行重复性、样品间精密度和耐用性验证,并对连续生产的3批重组人脑利钠肽进行pI分析。结果选择HR AESlyte 8-10.5为两性电解质,25 mmol/L氢氧化钠为占位剂,以87.5μg/mL为样品检测终浓度,聚焦时间为8 min。同一样品连续进样6次,检测pI相对标准偏差(RSD)为0.1%;6份样品检测pI RSD为0.1%;在样品不同终浓度下,主峰pI RSD为0.1%,不同放置时间下,样品pI RSD为0.1%,但pI标记物不可随意更改。连续3批重组人脑利钠肽样品pI均可检出。结论建立的重组人脑利钠肽pI分析的CIEF-WCID法,重复性好、精密度高,可用于重组人脑利钠肽后续的质量控制。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析重组蛋白质药物电荷异质性

目的 分析德谷胰岛素、苏金单抗、阿柏西普和重组人生长激素4种重组蛋白质药物的电荷异质性,为其质量检控提供可靠且快速的分析方法。方法 利用iCE3全柱成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing,iCIEF)分析仪对待测重组蛋白质药物进行检测,将待测样品与载体两性电解质按一定比例混合,在1 500~3 000 V聚焦条件下进行检测。结果 德谷胰岛素等电聚焦电泳图为单峰,等电点平均值为5.25。苏金单抗共检测到4个等电点,其中等电点8.66为主峰,占总峰面积的67.78%。阿柏西普共检测到12个等电点,有6个等电点的峰面积占总峰面积>10%,RSD均<0.10%。重组人生长激素共有3个等电点,其中等电点5.45为主峰占总峰面积的87.60%。结论 利用iCIEF技术能够有效检测德谷胰岛素、苏金单抗、阿柏西普和重组人生长激素的电荷异质性。该方法对4种蛋白质药物的质量检控具有重要意义。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

成像毛细管等点聚焦电泳法对单克隆抗体制品的电荷异质性分析

目的:采用成像毛细管等点聚焦电泳法分析单克隆抗体制品的电荷异质性。方法:应用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,对2种单克隆抗体制品酶切处理前后进行电荷异质性分析。结果:羧肽酶B处理前后的抗体1成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性引起;羧肽酶B处理和/或N-糖苷酶处理前后的抗体2成像毛细管等点聚焦电泳结果比较证明其电荷异质性主要由C末端赖氨酸不均一性和N-糖的唾液酸修饰引起。结论:采用优化的成像毛细管等点聚焦电泳技术,可较好地分析单克隆抗体产品的电荷异质性;并且配合合适的酶切处理,可判断单克隆抗体产品主要电荷异质性的来源,为保证单克隆抗体产品技术药物生产工艺的稳定性及质量控制提供了有效手段。

PEG化重组人促红素质量控制方法和标准研究

目的:建立PEG化重组人促红素质量控制方法和质量标准。方法:用正常小鼠网织红细胞计数法测定体内生物学活性,使用iCE毛细管等电聚焦电泳分析异构体,用离子色谱确定N-糖链指纹图谱,反相HPLC进行Lys-C蛋白内切酶酶切的肽图分析以及纯度测定。其余检测项目按2010年版中国药典三部方法进行。结果:建立的方法经过比较和对PEG化重组人促红素的检测,结果稳定可靠,重复性好,各指标符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010年版中国药典三部的要求。结论:本研究建立了一套完善的PEG化重组人促红素质量控制体系。