可乐定对严重烫伤大鼠心肌Giα表达的影响

目的 探讨可乐定对严重体表烫伤大鼠心肌抑制性G蛋白α亚基 (Giα)表达的作用及机制。方法 通过建立大鼠背部 3 0 %体表面积Ⅲ度烫伤模型 ,分别采用间接酶法、Westernblot测定了烫伤大鼠早期心肌AC活性、Giα水平。结果 可乐定 0 3、1、3mg kg ,可剂量依赖性地抑制烫伤后心肌Giα的增加。可乐定 0 .3～ 3mg kg还可显著升高烫伤后心肌AC基础活性 ,而 1～ 3mg kg可明显升高心肌Gpp (NH)p刺激活性 ,0 .3mg kg对心肌Gpp (NH)p刺激活性无明显影响 ;I1咪唑啉受体阻断剂efaroxan( 5、10mg kg)可部分逆转可乐定抑制烫伤大鼠心肌Giα升高的作用。结论 可乐定可抑制烫伤后心肌Giα的升高 ,其机制可能与可乐定激动I1

咪唑啉受体及其对阿片药理作用的调节机制

用稳定转染咪唑啉1型受体(I1R)的细胞(CHO-I1),对I1R信号转导途径进行了初步研究。首次直接证实I1R的信号转导途径与活化PC-PLC继而产生DAG,其后引起丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶促级联反应过程有关。采用共同稳定表达μ阿片受体(MOR)和I1R的CHO细胞表达系统(CHO-μ/I1细胞),对I1R在受体后水平抑制吗啡依赖的可能分子机制进行了研究。首次提供了胍丁胺通过作用于I1R而抑制吗啡依赖的直接实验证据,其分子机制可能主要是胍丁胺激活I1R抑制吗啡慢性处理时cAMP通路和Ca2+信号通路代偿性适应而抑制吗啡依赖的形成。

I_1咪唑啉受体对α_(2A)肾上腺素能受体表达和功能的影响

目的在细胞水平研究I_1咪唑啉受体(I_1R)对α_(2A)肾上腺素能受体(α_(2A)AR)表达及功能的影响。方法在完成小鼠I_1R基因和α_(2A)AR基因的质粒测序及酶切鉴定后,分别转染CHO细胞,采用放射性配体-受体结合实验、流式细胞分选技术进行阳性细胞单克隆筛选,建立分别稳定表达I_1R和α_(2A)AR的CHO细胞系,以及共同稳定表达I_1R与α_(2A)AR的CHO细胞系。采用放射性配体-受体结合实验确定α_(2A)AR的亲和力及表达量,用Western印迹法研究I_1R对α_(2A)AR表达量的影响和对α_(2A)AR激动剂右美托咪定刺激细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化作用的影响。结果在转染小鼠I_1R和α_(2A)AR基因质粒后,CHO细胞生长正常。在为稳定表达小鼠α_(2A)AR的CHO细胞膜蛋白所做的放射性配体饱和实验中,3H-RX821002的Kd和Bmax值分别为(0.96±0.24)nmol/L和(0.29±0.03)nmol/g蛋白。在稳定表达小鼠I_1R的CHO细胞以及稳定表达小鼠α_(2A)AR的CHO细胞中再分别转染I_1R基因后,I_1R蛋白表达水平均明显上升(P<0.05,P<0.01)。在共同稳定转染I_1R和α_(2A)AR的CHO细胞系中,I_1R的表达上调了CHO细胞中α_(2A)AR的表达水平(P<0.01),同时也进一步上调了右美托咪定激活α_(2A)AR引起的ERK磷酸化水平(P<0.01)。结论在外源表达的细胞系中,I_1R上调α_(2A)AR蛋白的表达和右美托咪定激活α_(2A)AR后的ERK磷酸化水平。本研究为后续分子水平深入探索I_1R和α_(2A)AR之间的相互作用奠定了基础。

经不同咪唑啉类药物长期处理后大鼠脑内I_2R密度及胶质纤维酸性蛋白的变化

目的:观察咪唑啉类药物长期处理后大脑组织中咪唑啉2受体(I_2R)密度和亲和力的变化以及对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法:将大鼠随机分成生理盐水组、胍丁胺组、育亨宾组、咪唑克生组、左旋咪唑组及2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)组,腹腔注射×2周。采用放射性配体结合试验检测大脑和脑干匀浆中I_2R B_(max)和K_d变化,免疫组化测定小脑和颈髓中GFAP的表达。结果:反映I_2R密度的B_(max)值,咪唑克生、2-BFI和左旋咪唑组较NS组分别上调了80%、93%和122%(均P<0.01)。反映受体亲和力的K_d值,各组间无明显差异。咪唑克生、2-BFI和左旋咪唑组中GFAP表达比生理盐水组明显增加(均P<0.01)。结论:咪唑克生、2-BFI和左旋咪唑表现为拮抗剂特性;I_2R可能参与调节GFAP表达。

咪唑啉Ⅰ型受体候选蛋白——非G蛋白偶联受体信号转导与ERK相关

目的:研究在咪唑啉Ⅰ型受体(imidazoline-1receptor,I1R)激动剂莫索尼定和利美尼定作用下,I1R抗体选择性蛋白(imidazolinereceptorantiseraselectedprotein,IRAS)的信号转导机制。方法:采用[35S]-GTPγS结合实验,确定IRAS是否与G蛋白相偶联;采用蛋白免疫印迹方法,研究IRAS的激活与ERK磷酸化之间的关系。结果:以稳定表达有IRAS的CHO细胞(CHO-IRAS)为实验对象研究发现,利美尼定、莫索尼定在多种实验条件下均不能提高[35S]-GTPγS结合量,表明IRAS不与G蛋白偶联,而利美尼定和莫索尼定在激活IRAS的同时,能够浓度依赖性地显著升高ERK磷酸水平,其刺激作用能被I1R拮抗剂依法克生完全拮抗。结论:IRAS不与G蛋白偶联,ERK可能是IRAS偶联的信号分子之一。

咪唑克生对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠MCP-1、MIP-1α表达的影响

目的:探讨不同剂量咪唑克生(Ida)对Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中枢神经系统(CNS)内单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)表达的影响。方法:以豚鼠脊髓匀浆加完全福氏佐剂免疫Wistar大鼠,建立EAE模型。观察Ida0.5、1.5和4.5mg·kg-1剂量组对大鼠的EAE发病率、神经功能缺损评分的影响,应用苏木精-伊红和Kluver & Barrera髓鞘染色方法观察大鼠CNS病理变化,采用免疫组织化学技术检测大鼠CNS内MCP-1、MIP-1α表达的变化。结果:Ida1.5和4.5mg·kg-1组的EAE发病率和神经功能缺损评分均明显降低,Ida3个不同剂量Ida干预组的CNS内MCP-1、MIP-1α的表达呈现不同程度地减少。结论:不同剂量的Ida能改善EAE,以1.5和4.5mg·kg-1组的效果更显著。推测可能与咪唑啉2受体有关。

咪唑啉受体抗血清选择性蛋白的表达、纯化及单克隆抗体制备

目的:表达和纯化咪唑啉受体抗血清选择性蛋白(imidazoline receptor antiserum-selected protein,IRAS pro-tein),制备IRAS蛋白的单克隆抗体。方法:采用基因重组技术在大肠杆菌表达IRAS蛋白;金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化;杂交瘤技术建立分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株;以间接ELISA方法筛选分泌特异性IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞;采用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体的特异性。结果:成功表达并纯化了IRAS重组蛋白,纯度达到95%。共筛选出5株分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化了IRAS的单克隆抗体,腹水中单克隆抗体效价分别为1∶8×106,1∶2×106和1∶5×106,属于IgG1亚型。该抗体能与原核及真核系统表达的IRAS重组蛋白发生特异性反应,间接免疫荧光显示IRAS蛋白主要定位于细胞质中。结论:建立了稳定分泌IRAS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,成功制备了特异性好的IRAS单克隆抗体,为研究IRAS的功能提供了有力的研究工具。