免疫亲和层析技术协同酶联免疫吸附法检测赭曲霉毒素A

利用免疫亲和层析技术(immunoaffinity chromatography,IAC)对样品中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)进行捕获与浓缩,利用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法对IAC捕获的目标物OTA进行测定。IAC与ELISA中的抗OTA单克隆抗体来自不同的克隆株,分属不同独特型,与OTA结合靶点的选择性存在差异,IAC与ELISA协同检测,可以有效过滤OTA结构类似物造成的干扰,提高免疫分析的特异性与灵敏度。该方法用于加标样品测定时,OTA的检出限为0.2 ng/g,定量限为0.4 ng/g,OTA的平均回收率为75.9%,与单一的ELISA法相比,该方法虽然回收率略低,但灵敏度可以显著提高,达到ELISA法的60倍。通过对49份样品的实际检测,该方法检出阳性样品与国标法的符合率达到100%,漏检率为0%,由此可见,该方法在准确性上表现出明显的优势。作为一种综合免疫分析技术,该方法不需要大型仪器设备,对操作环境没有严格要求,便于基层实验室对样品中OTA的分析。

基于纳米抗体的可再生免疫亲和柱结合高效液相色谱-串联质谱法测定玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxinB_(1),AFB_(1))纳米抗体的表达产量的影响因素,开发具有可再生性的AFB_(1)免疫亲和柱,构建免疫亲和处理-高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定玉米中AFB_(1)污染的分析方法。方法研究诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等对AFB_(1)纳米抗体表达量的影响,比对验证AFB_(1)纳米抗体可再生免疫亲和柱的耐受性和可再生使用次数。使用70%甲醇水溶液提取玉米样品中AFB_(1),提取液通过免疫亲和柱净化富集后进行HPLC-MS/MS检测,最后进行方法学验证并应用到实际样品检测。结果诱导AFB_(1)纳米抗体表达的最优条件分别为诱导温度16℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间14 h,在最优条件下产量可达7.8 mg/L。AFB_(1)纳米抗体具有良好灵敏度、亲和性、特异性和甲醇耐受性,制备的AFB_(1)免疫亲和柱具有极好的可再生性,重复使用150次以上,对AFB_(1)回收率仍可达80%以上。同时,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS,在0.1~100.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.014μg/L,定量限为0.047μg/L。在3个不同加标浓度下,回收率在92.0%~104.1%,变异系数小于3.9%。结论本研究开发的AFB_(1)纳米抗体免疫亲和柱表现出优秀的再生性和高特异性,节约了检测成本,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS检测方法操作简便、回收率高、结果准确,适用于实际玉米样品中AFB_(1)的含量测定。

马杜霉素在鸡组织中残留检测方法的研究 Ⅱ 免疫亲合色谱—酶联免疫吸附法(IAC—ELISA)

本文首次报道ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ方法测定鸡组织中马杜霉素的残留。制备针对马杜霉素的特异性抗体ＩｇＧ和高容量ＩＡＣ柱（Ｉ柱动态柱容量为７ １６０ｎｇ·ｍｌ－ １ｇｅｌ，Ⅱ柱为３ ７５０ｎｇ·ｍｌ－ １ｇｅｌ） 。组织样品用甲醇提取，经ＩＡＣ柱分离纯化，ＥＬＩＳＡ检测，即ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ 方法。本试验揭示，以组织样本提取纯化稀释液为介质制备的标准曲线（Ｉ５０ 为３３３ ～３７１ｎｇ·ｍｌ－ １ ，斜率为１９５ ～２２０ ，检测极限为１０ ～２８ｎｇ·ｇ－ １） ，其Ｉ５０ 值和斜率与以ＰＢＳＴ－ １０ ％ 甲醇为介质的标准曲线相符，实际ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ检测时，各组织的标准曲线可用后者代替，使操作大为简化、实用。各组织添加马杜霉素３００ ～１２０ ．０μｇ·ｋｇ － １ 水平下，测得样本回收率为７６４ ％ ～１０９ ．０ ％ ，变异系数为３８ ％ ～１６ ．４ ％ 。结果证明了该方法的可靠性。本文建立的ＩＡＣ—ＥＬＩＳＡ法是目前国内外唯一报道的最简便、灵敏的马杜霉素残留检测方法。

免疫亲和色谱-气相色谱/质谱法(IAC-GC/MS)检测猪肝中的沙丁胺醇与克伦特罗

制备出抗沙丁胺醇的抗血清,提取、纯化IgG制备免疫亲和色谱柱,针对沙丁胺醇与克伦特罗的动态柱容量分别为400 ng/mL基质和416 ng/mL基质。猪肝样品匀浆后用稀盐酸提取,经免疫亲和色谱柱纯化,再用GC/MS检测,即为IAC-GC/MS法。对沙丁胺醇的检测限为0.5 ng/g,定量限为2 ng/g,对克伦特罗的检测限为0.8ng/g,定量限为2.5 ng/g。空白组织按照1、5、10、20 ng/g的浓度添加药物,沙丁胺醇在空白肝中的添加回收率为78.4%-106.9%,克伦特罗的添加回收率为77.1%-102.9%。本研究建立的检测猪肝中沙丁胺醇与克伦特罗的IAC-GC/MS法乃国内首次报道。

高效液相色谱法测定薏苡仁中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

目的:构建免疫亲和柱净化与高效液相色谱法相结合以测定薏苡仁中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的方法。方法:薏苡仁经粉碎处理,用水提取,经免疫亲和柱上样、净化和洗脱后,用高效液相色谱仪测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。结果:在40~400 ng·mL^(-1),脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为1,检出限为9.6μg·kg^(-1),定量限为28.8μg·kg^(-1),回收率为90.7%~106.2%,相对标准偏差均小于4%。结论:该方法操作步骤简便,专属性强,精密度高,可以作为测定薏苡仁中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的方法。

粮食中玉米赤霉烯酮含量测定的前处理方法优化

优化GB 5009.209—2016高效液相色谱法前处理过程,建立新的粮食中玉米赤霉烯酮含量的高效液相色谱测定方法。样品经乙腈-水(V_(乙腈):V_(水)=4∶1)调速振荡器提取,免疫亲和柱富集净化,甲醇洗脱后,直接用水稀释定量至2.00 mL,采用C_(18)反相色谱柱(150 mm×4.6 mm,5.0μm),在10~500 ng/mL的质量浓度范围内线性关系良好,其相关系数R^(2)为0.999,检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为3.8μg/kg、12.8μg/kg,3个浓度水平加标回收率为94.3%~106.3%,精密度为0.8%~6.1%,连续4天的基质加标回收率为96.7%~104.8%,日间精密度为0.8%~4.3%,高效液相色谱可以很好地对粮食中玉米赤霉烯酮进行快速准确定量分析。经验证该方法与国标方法检测结果无显著性差异。与国标相比,尤其是本方法通过去除氮吹、省去流动相复溶步骤可实现快速、简便、批量检测,提高了工作效率。

Preparation and Application of an Immunoaffinity Column for Direct Extraction of Morphine and its Analogs from Opium

A rapid, simple and accurate method using an immunoaffinity column (IAC) and capillary electrophoresis (CE) for the analysis of the major alkaloids in opium is developed. The IAC was synthesized by coupling specific morphine polyclonal antibodies to CNBr-actived Sepharose 4B. The IAC showed high selectivity and obvious enrichment to morphine, codeine, dionin and thebaine. The extraction solution was analyzed by CE with β-cyclodextrin as an additive. Recoveries of the four alkaloids from PBS were between 93%-105% with RSD value less than 5.0%. The result showed that this method was practical for the determination of morphine analogs in opium.

茶叶农残复合型IAC柱制备与性能评价

本研究采用溴化氰活化琼脂糖凝胶4B与多菌灵、啶虫脒、吡虫啉抗体偶联,制备复合型农残免疫亲和层析色谱柱(IAC柱),并且开展了系列性能评价实验。该柱对上述3种农药残留的柱容量分别是311、304、103 ng。通过梯度洗脱测试,3 mL甲醇可将IAC柱中的农药残留洗脱完全。IAC柱重复使用测试结果表明,对多菌灵可多次重复使用,但是不适用于吡虫啉和啶虫脒的重复使用。IAC柱的特异性测试结果表明,对茶叶中少量常见农药存在一定的非特异性吸附能力。

免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中8种霉菌毒素

目的:建立免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定水产品中8种霉菌毒素残留。方法:样品经乙腈水溶液(84:16,V:V)提取,多毒素免疫亲和柱净化。色谱柱为Agilent Proshell 120 SB·C_(18)(2.1 mm×100 mm,2.7μm),流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温为40℃。采用电喷雾离子源正负离子同时扫描,多反应监测模式(MRM)进行质谱检测。结果:8种霉菌毒素在1.0~50.0 ng/mL范围内线性关系良好(R2>0.992),方法检出限在0.05~0.50μg/kg之间,定量限在0.17~1.65μg/kg之间;8种霉菌毒素加标回收率在75.6%~106.3%之间,相对标准偏差(RSD)为3.5%~9.3%。结论:该方法操作便捷、灵敏度高、准确可靠,能满足水产品中多种霉菌毒素残留快速检测需求。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的五氯苯酚

目的 构建复合免疫亲和柱净化,高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)测定母乳中五氯苯酚残留的分析方法。方法 母乳样品用5%三乙胺乙腈水(7:3, V/V)提取,经免疫亲和柱特异性净化,以含0.05%氟化铵的甲醇和含0.05%氟化铵的超纯水为流动相,梯度洗脱, ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式检测,内标法定量分析。结果 五氯苯酚在0.02~20.00μg/L范围内呈现良好线性关系,相关系数达0.9998;在低、中、高3个不同加标浓度下,回收率在98.72%~106.95%之间,相对标准偏差小于6.09%,基质效应在94.45%~101.61%之间;方法的检出限为0.008μg/L,定量限为0.02μg/L。免疫亲和柱在该实验条件下至少可重复使用8次,降低87%以上的实验成本。结论 本方法基于免疫亲和柱对样品进行特异性净化,重现性好、准确度高,能够有效地分离和检测母乳中的五氯苯酚残留,可应用于母乳样品中五氯苯酚的定性定量检测。

高通量自动化免疫磁珠净化-超高效液相色谱法检测饲料中4种黄曲霉毒素

黄曲霉毒素(AFT)是一种毒性极强的剧毒物质,具有致癌性。饲料原料及产品在生产、运输和储藏等过程存在被黄曲霉毒素污染的风险。该文建立了高通量自动化免疫磁珠净化-超高效液相色谱法测定饲料中4种黄曲霉毒素(黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))、黄曲霉毒素B_( 2)(AFB_(2))、黄曲霉毒素G_(1)(AFG_(1))和黄曲霉毒素G 2(AFG_(2)))的分析方法。饲料样品用乙腈-水(70∶30,v/v)提取,经免疫磁珠自动净化后,使用超高效液相色谱进行分析测试。对磁珠与抗体的偶联比例、免疫磁珠与黄曲霉毒素的反应时间、样品提取液和稀释液等关键实验条件进行了优化,考察了不同饲料样品的净化效果。在优化条件下,豆粕、玉米干酒糟及其可溶物、猪饲料和鸡饲料等4种常见饲料样品在3个水平(5、20和40μ[g/kg,以AFB_(1)计)下的加标回收率在91.1%~119.4%之间,相对标准偏差小于6.9%;日间精密度为4.5%~7.5%,该方法具有良好的重复性。采用该法检测质量控制样品中AFB_(1)的含量,平均值为18.6μ[g/kg(n=3),准确度为110.3%,测试结果满意。使用该法测试了21种随机购买的饲料样品,其中有4份样品测出含有AFB_(1)。本方法所使用的自动净化系统能够自动净化饲料中的4种黄曲霉毒素,并实现样品的批量处理,每批可最多同时净化24个样品,批处理总用时约为30 min;超高效液相色谱法分析速度快,准确性高,可用于检测饲料中黄曲霉毒素的含量。

免疫亲和柱结合超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的16种真菌毒素比较研究

目的通过比较5种不同商品化多合一免疫亲和柱的可检测目标毒素种类、回收率和稳定性,筛选性能最优的免疫亲和柱,建立免疫亲和前处理-超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定牛奶中16种真菌毒的方法。方法牛奶样品分别经5种不同多毒素免疫亲和柱进行净化富集,用优化后的UPLC-MS/MS,在多反应监测模式下测定,同位素内标法定量,筛选覆盖牛奶中真菌毒素污染种类全面、回收率和稳定性最佳的免疫亲和柱,并进行免疫亲和柱性能评价和方法学验证,最终将方法应用于实际样品检测。结果免疫亲和柱A对牛奶中16种真菌毒素在低、中、高3个添加水平均具有良好的准确度和精密度,加标回收率在83.6%~126.8%之间,相对标准偏差为0.2%~18.4%。柱A内各毒素残留水平低于仪器检出限,柱容量在21.8~1317.5 ng之间。使用免疫亲和柱A富集净化样品,各目标毒素在线性范围内线性良好,相关系数均大于0.99,定量限为0.0010~0.2000ng/g。应用该方法对牛奶质控样品和实际样品进行检测,质控样品测定值均在标示范围内;实际样品中能够检出较低水平的黄曲霉毒素M_(1)、去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马毒素B1。结论本研究验证筛选免疫亲和柱A应用于牛奶中16种真菌毒素的测定,其柱残留和柱容量能够满足牛奶中真菌毒素污染的测定;经方法学验证该方法准确可靠、灵敏度高,适用于牛奶中16种真菌毒素的日常检测。

全自动免疫磁珠法与免疫亲和柱法测定食用油中黄曲霉毒素B1的对比研究

采用全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化的前处理方法,结合超高效液相色谱法对不同食用油中黄曲霉毒素B1进行定量检测,并对两种前处理方法结果准确性、加标回收率、检测时间进行了对比。结果表明:全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化测定植物油标准物质,结果分别为15.59μg/kg和14.64μg/kg,均在标准值范围内;对不同种类食用油添加不同量的黄曲霉毒素B1标准物质,加标回收率均在88%~110%之间,相对标准偏差均在5%以内。采用Bland-Altman法对全自动免疫磁珠净化法和免疫亲和柱净化法进行差异分析,结果显示这两种净化方法的差异在可接受范围内。两种方法在净化和富集食用油中黄曲霉毒素B1均可满足实验要求,可以互相代替使用。通过检测时间对比,全自动免疫磁珠净化搭配使用真菌毒素全自动净化仪前处理方法可同时处理多个样品,平均一个样品净化时间小于3 min,处理时间短、实验效率更高。

高效液相色谱法测定茶叶中6种真菌毒素

目的:建立了同时测定茶叶中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、玉米赤霉烯酮等6种真菌毒素免疫亲和柱-高效液相色谱检测方法。方法:样品经粉碎,乙腈-水(体积比为86:14)超声提取,自制复合免疫亲和柱净化,Accurasil C18柱(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱分离,甲醇-乙腈(体积比为1:1)和水为流动相梯度洗脱,二极管阵列检测器串联在线柱后光化学衍生装置和荧光检测器同时检测,外标法定量。结果:茶叶中的6种真菌毒素在各自浓度范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999;3个不同添加水平的平均加标回收率为68.0%~88.3%,相对标准偏差(n=6)为2.6%~9.2%,检出限(S/N=3)为0.12~10.0μg/kg。结论:该方法简便、高效、抗基质干扰能力强,大大降低假阳性样品的检出率,可满足各种茶叶中6种真菌毒素同时检测的需求。

UPLC-Q-Orbitrap HRMS结合全碳标记稳定同位素内标法精确测定粮油中黄曲霉毒素

建立了全自动免疫亲和柱净化-超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)结合全碳标记稳定同位素内标法对粮油中四种黄曲霉毒素精确定量方法。样品准确称量后加入全碳标记稳定同位素内标,经84/16(V/V)的乙腈/水提取、离心、稀释后,通过全自动固相萃取仪采用黄曲霉毒素免疫亲和柱进行全自动净化,净化液在UPLC-Q-Orbitrap HRMS上进行检测后采用内标法进行定量分析。结果表明:黄曲霉毒素的加标回收率为84.7%~104.6%,日内相对标准偏差为1.7%~9.4%,日间精密度为0.7%~8.4%。采用本方法对国家标准物质的检测结果在赋值范围内,能够最大限度地降低实验人员工作量,提高工作效率,避免因人员操作失误导致的结果偏差,适用于粮油中黄曲霉毒素的精准测定,可满足日常检测和监测需求。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱技术检测食品中呕吐毒素的方法优化

目的:建立了基于优化的免疫亲和柱净化高效液相色谱技术的呕吐毒素检测方法。方法:优化的免疫亲和柱淋洗条件为将1.5 mL甲醇以0.5 mL·min^(-1)的流速分3次洗脱;优化的流动相为乙腈∶水=10∶90。结果:当呕吐毒素的载柱量在12.4~2504.0 ng时,柱回收率为82.6%~103.2%;在98.6~4930.0 ng·mL^(-1)时,呕吐毒素的校正曲线为y=0.06335x-0.81590,相关系数为0.999921。以优化后的实验方法分析小麦粉、醋和黄酒中的呕吐毒素,检出限为1.2~4.2μg·kg^(-1),定量限为4~14μg·kg^(-1);3种食品中呕吐毒素的3水平平均加标回收率为84.3%~104.7%,实验室内变异系数为0.3%~5.5%;对特性值为1303μg·kg^(-1),特性值区间为1043~1563μg·kg^(-1)的小麦粉质控样品中呕吐毒素的含量进行检测,结果为1320μg·kg^(-1)。结论:优化后的检测方法灵敏、准确,适用于食品中呕吐毒素的检测。

色谱及质谱检测技术在食品真菌毒素检测中的应用研究

为了检测食品中的真菌毒素,本文对其检测流程及步骤进行深入分析,并提出同时使用色谱及质谱检测技术对粮食承储企业稻谷的真菌毒素进行检测。研究发现,在加标量为2~800μg·kg^(-1)时,粮食中6种真菌毒素的平均回收率为75.5%~102.5%,批内的相对标准偏差为3.7%~9.7%,均满足食品理化检测要求。由此可知,色谱及质谱检测技术适用于对粮食中多组分真菌毒素进行定量与定性检测。

乳制品中AFT M_(1)和AFT M_(2)的系统适应性试验的验证

为了准确测定黄曲霉毒素M_(1)(AFT M_(1))和黄曲霉毒素M_(2)(AFT M_(2))的含量,本文采用高效液相色谱法对AFT M_(1)和AFT M_(2)的系统适应性试验进行了验证。在0~5 ng·mL^(-1),AFT M_(1)和AFT M_(2)均呈现良好的线性关系。免疫亲和柱的验证、方法检出限和定量限均符合GB 5009.24—2016规定,AFT M_(1)和AFT M_(2)的回收率符合GB/T 27404—2008规定。使用该方法对9个乳制品进行了测定,发现样品中AFT M_(1)和AFT M_(2)可准确测得。

免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱法测定牛奶中的三聚氰胺

本文建立了牛奶中三聚氰胺的免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱分析方法,样品经简单稀释即可经免疫亲和柱净化后用液相色谱串联质谱法检测,内标法定量。相关系数r~2为0.999 74,线性范围为1~100 ng/m L,最低检出限(LOD)为0.000 10 mg/kg,定量限(LOQ)为0.000 24 mg/kg,回收率在97.4%~100.6%。结果表明,该方法具有较高的准确度和灵敏度,可满足实际样品检测需求。

粮食中呕吐毒素含量的免疫亲和柱净化超高效液相色谱法快速测定

建立了免疫亲和柱净化/超高效液相色谱法快速测定粮食中呕吐毒素(DON)的检测方法。样品经纯水提取后,用免疫亲和柱净化、浓缩,Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱柱分离,以甲醇-水(10∶90)为流动相,流速为0.1 mL/min,进样量1μL,用Acquity紫外检测器在220 nm处进行检测,保留体积不足0.5 mL,整个分析过程用时不足45 min。呕吐毒素在0.5～10.0 mg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.999 96;检出限(S/N=3)为0.15 ng,定量下限(S/N=10)为0.5 ng,加标回收率为84%～98%,相对标准偏差为2.9%～5.9%。该方法简便快速、灵敏度高、重现性好、溶剂用量少且环保,适用于原粮中呕吐毒素的快速测定。