樱桃小果病毒1号胶体金免疫层析试纸的研发与应用

近年来,病毒病在甜樱桃主产区的发生呈上升趋势,制约了甜樱桃产业升级和发展。能够侵染甜樱桃的病毒种类中,樱桃小果病毒1号(little cherry virus 1,LChV-1)导致樱桃果实缩小,彻底丧失经济价值,对甜樱桃产量影响较大。LChV-1通常具有潜伏侵染的特性,在樱桃苗期难以通过症状进行判断。同时,多数品种对LChV-1敏感,因此该病毒的早期检测对甜樱桃的生产尤为重要。传统的病毒检测手段需要专业仪器,不能满足田间快速检测的需求。本研究获取了LChV-1外壳蛋白的多克隆抗体,并研发了一种能够准确检测LChV-1病毒的胶体金免疫层析试纸,确定了胶体金的最佳抗体标记浓度为0.24 mg/mL,检测线最佳重组蛋白浓度为0.25 mg/mL,质检线最佳羊抗兔IgG抗体浓度为0.04 mg/mL。运用该试纸检测只需10~15 min,检测时间短、成本低、结果容易判断,可用于田间快速检测。本研究为樱桃小果病的综合防控提供了有效的监测和检测手段。

基于“遗传标志物”紫河车DNA指纹-试纸条分子鉴定方法及试剂的研究

目的:建立中药材紫河车遗传标志物DNA指纹-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发一体化质量控制基因检测试剂盒。方法:自主研发紫河车模板DNA提取的方法及试剂,根据人mtDNA cytb基因设计种属特异性引物,引物的5'端分别用FAM、Biotin标记,筛选PCR最佳退火温度及循环次数,建立DNA指纹分子鉴定方法,研发PCR基因检测试剂预混液,采用分子克隆及基因测序技术制备对照药材DNA克隆液,利用免疫胶体金试纸条进行结果检测,开发出集“DNA提取试剂、PCR基因检测试剂预混液、对照药材DNA克隆液、空白对照液、试纸条”为一体的快速基因检测试剂盒,并进行特异性、重现性、灵敏性、稳定性的评价。结果:自主研发的DNA提取试剂提取的模板DNA质量浓度均在150~280 ng·μL^(-1),纯度均在1.8~1.9,琼脂糖凝胶电泳无拖尾。紫河车特异性引物在退火温度59℃、循环20次时;免疫胶体金试纸条显示:紫河车对照药材及正品出现2条红色条带,易混品及空白对照出现1条红的条带。琼脂糖凝胶电泳验证正确。对照药材DNA测序结果与人mtDNA cytb基因同源性100%。自主研发的一体化快速基因检测试剂盒的特异性强,重现性好,稳定性好,灵敏度为0.1 ng·μL^(-1)。结论:DNA指纹-免疫胶体金试纸条分子鉴定方法能够特异、准确、快速、可视化地对紫河车的真伪进行鉴定,一体化快速基因检测试剂盒为紫河车质量控制提供规范化、标准化的检测方式,更适合现场实地检测,可普遍推广使用。

基于两个重组蛋白的牛支原体免疫胶体金抗体检测试纸条的研究

本研究以牛支原体(Mycoplasma bovis)重组膜蛋白P48、P80和鸡IgY抗体标记胶体金溶液,以蛋白A和蛋白G包被T线,山羊抗鸡IgY包被C线,制备检测牛支原体抗体的胶体金免疫层析试纸条。用本实验室保存的39份牛支原体感染来源血清、56份免疫来源血清以及142份临床血清对研制的试纸条进行质量评估。结果显示,该试纸条能检测出感染和免疫14 d后的牛血清中的牛支原体抗体,对感染来源血清敏感性为95.83%、特异性为93.75%,对免疫来源血清的敏感性为92.31%、特异性为93.75%,对临床血清的敏感性为90.12%、特异性为98.36%。上述结果表明,该试纸条能用于牛支原体抗体现场快速检测、群体监测和辅助诊断。

中药材蛤蚧PCR-试纸条快速分子鉴定方法及检测试剂的研究

目的建立中药材蛤蚧聚合酶链反应(PCR)-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发快速基因检测试剂盒。方法筛选提取基因组DNA的方法及试剂,根据蛤蚧mtDNA cytb基因设计种属特异性引物并标记,筛选最佳反应条件,研发PCR基因检测试剂,采用分子克隆及基因测序技术制备对照药材DNA克隆液,利用免疫胶体金试纸条进行结果检测。进而,开发出一体化快速基因检测试剂盒,并对特异性、重现性、灵敏性、稳定性进行评价。结果基因组DNA的完整性、浓度、纯度均满足PCR的要求,引物在退火温度63℃时,循环20次时,免疫胶体金试纸条显示:蛤蚧对照药材及正品出现两条红色条带,易混品及空白对照出现一条红的条带。琼脂糖凝胶电泳验证正确。对照药材克隆测序结果于蛤蚧mtDNA cytb基因同源性100%。一体化快速基因检测试剂盒的特异性强、重现性好、稳定性好、灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳10倍。结论PCR-免疫胶体金试纸条鉴定方法能够特异、准确、快速、可视化地鉴定蛤蚧的真伪,一体化快速检测试剂盒使鉴定方法更加规范化、标准化,更适合实地现场检测、适合普遍推广使用。