突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达

采用PCR技术,从质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57中分别获取含CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的人甘露聚糖结合凝集素(MBL)突变体全长编码区cDNA序列,将其分别插入质粒pcDNA4/HisMax C中,构建成相应的3种真核表达载体。将各突变型MBL基因的真核表达载体和野生型MBL基因真核表达载体以脂质体法分别转染COS7细胞。72 h后,以双抗体夹心ELISA技术检测各细胞培养上清中目的蛋白的含量分别为0.980μg/ml、0.971μg/ml、0.900μg/ml和1.047μg/ml;用One-way ANOVA分析这些目的蛋白的含量无显著性差异(P>0.05)。因此,MBL结构基因的点突变并不影响MBL蛋白的合成与分泌。

人转化生长因子β1 cDNA在COS－7细胞中的表达

在测定了ＴＧＦβ１全长序列的基础上，构建了两个ＴＧＦβ１的表达载体ｐＣＭＶβ和ｐＳＶＬβ；分别从转录水平和翻译水平检测了这两个载体在ＣＯＳ－７细胞中的表达。同时利用ＣＯＳ－７短暂表达系统，建立了ＴＧＦβ１的生物测活法；并分别研究了上清收获时间、表达载体。

HLA—A＊0201的cDNA克隆及在COS—7细胞上的瞬时表达

目的 :克隆HLA A 0 2 0 1编码区的cDNA ,并建立在COS 7细胞上的瞬时表达系统。方法 :采用逆转录 PCR技术从HLA A 0 2 0 1阳性的淋巴细胞中获得HLA A的cDNA ,将其定向克隆至载体pBluescriptIISK(+ / - )中 ,经测序确证后 ,将该基因插入真核表达载体pcDNA3中 ,通过阳离子脂质体介导转染至COS 7细胞 ,用流式细胞仪测定细胞表面HLA A 0 2 0 1分子的瞬时表达。结果 :获得的HLA A 0 2 0 1基因的cDNA序列与Genebank登录的cDNA序列一致。FACS检测结果显示 ,COS 7细胞上HLA A 0 2 0 1的表达率为 5 3%。结论 :成功克隆HLA A 0 2 0 1基因 ,并实现了在COS 7细胞上的瞬时表达 ,为研究HLA

人牙本质涎蛋白在COS-7细胞中的表达

目的 :构建人牙本质涎蛋白 (humandentinsialoprotein ,hDSP)真核表达载体 ,用瞬时系统表达目的基因。方法 :将hDSP全长基因定向克隆入真核表达质粒载体pcDNA3 ,构建pcDNA3 hDSP重组质粒 ,脂质体转染法转染COS 7细胞 ,48～ 72h收集细胞及培养上清 ,Westernblot和免疫组化检测表达产物。结果 :酶切鉴定表明重组表达载体构建成功 ;Westernblot检测显示在 60 0 0 0处出现一条清晰的特异性免疫阳性条带 ;免疫组化染色显示细胞胞质内有大量棕黄色颗粒 ,进一步证明该转染方法可行 ,转染效率较高。结论 :hDSP全长基因可以在COS 7细胞获得瞬时高效表达。

人IL-18结合蛋白AcDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人IL-18结合蛋白A（hIL-18 BPa）的 cDNA,观察其在COS-7中的表达。方法 采用RT-PCR自人白血病细胞株jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA,将其克隆至T-vector中,经测序确证后,将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1（+）中。脂质体介导法将其转染COS-7细胞,72h后收集上清纯化,用BCA法测定hIL-18 BPa的含量,用ELISA法测定其活性。结果获得的IL-18BPa的cDNA序列与gene bank登录的cDNA序列一致。上清液中hIL-18 BPa含量为1.4mg/L,并具有良好的生物学活性。结论 成功克隆hIL-18 BPa基因,并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达,为研究其活性奠定了基础。

用脂质体法转染 COS-7 细胞条件的优化

现有的多种真核细胞基因转染方法存在繁琐和效率低的问题，我们利用脂质体包裹的方法，以瞬时表达系统中最常用的ＣＯＳ－７细胞为靶，观察了影响转染效率的多种因素，优化了转染条件。

真核表达载体pIRES2-EGFP-V13KL的构建及在COS-7细胞和小鼠胚胎中的表达

构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-V13KL,瞬时转染COS-7细胞及对小鼠受精卵进行原核注射,旨在通过抗菌肽V13KL在COS-7细胞、小鼠胚胎中的表达情况评价其对细胞生理状态、胚胎发育方面可能产生的影响。结果显示,V13KL可以与EGFP在COS-7细胞中高效共表达,转染效率为75.8%,且原核注射后约10%的胚胎发育成带有绿色荧光的囊胚。