胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。

鸡缩胆囊素-33串联体的构建、原核表达及免疫原性研究

根据鸡缩胆囊素(choleystok in in,cck)-33基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子,设计了大肠杆菌表达系统偏爱的cck基因序列.将cck-33基因克隆至pRSET A质粒上,利用载体上的同尾酶构建cck基因四串联体并在大肠杆菌E.coliBL 21中成功表达.将所表达的融合蛋白进行纯化后,以纯化的蛋白为免疫原制备油佐剂疫苗主动免疫胡须肉鸡.结果表明,CCK蛋白主动免疫肉鸡后,抗血清水平显著升高,P/N值远远大于2.

LHRH-PE40的免疫原性及其抗体对细胞毒作用的影响

目的观察连续静脉注射重组毒素LHRH-PE40所引起的家兔抗LHRH-PE40抗体产生的规律以及该抗体对细胞毒作用的影响。方法将家兔分为3组,第1组隔日连续静脉注射LHRHPE40,第2组用弗氏佐剂乳化的LHRHPE40皮下注射为阳性对照组,第3组静脉注射人血白蛋白为阴性对照组。用ELISA检测血清中的抗体水平,XTT检测LHRH-PE40与血清中和后对Hela细胞的细胞毒作用。结果抗LHRHPE40抗体水平随静脉注射时间的延长而升高,8d可以检测到抗LHRH-PE40抗体,在24d基本达到最高水平。血清中和后LHRHPE40对Hela细胞的半数抑制量较阴性血清提高1～2倍,而阳性血清较阴性血清提高14倍。结论连续静脉注射LHRH-PE40产生较低水平的抗体,这种抗体未造成LHRHPE40对Hela细胞半数抑制量产生严重影响,这为临床连续使用LHRH-PE40提供了依据。

1型和14型肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗中糖链长度与免疫原性的相关性

目的探讨1型、14型肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗中糖链长度和免疫原性的相关性,以解决多糖结合物难以纯化的问题。方法肺炎球菌荚膜多糖经过乙酸水解成为寡糖,与原糖采用相同的方法与破伤风类毒素结合,免疫小鼠后检测抗体水平,并与原糖结合物进行比较。结果小鼠体内均能产生较高的抗体水平,且具有免疫加强效应,寡糖结合物与原糖结合物的免疫原性差异无显著意义。结论1型、14型肺炎球菌的荚膜多糖经酸水解降解,不影响结合物的免疫原性。

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。

中国强毒赖型钩端螺旋体新基因OmpL17的表达及其免疫原性

将Omp L17基因克隆于p GEX- 1λT载体,在大肠杆菌JM10 9中表达分子量约为5 4 KDa的GST-Omp L17融合蛋白,凝血酶切割后得到了大小约2 8KDa的Omp L17蛋白。用纯化的Omp L17蛋白免疫大白兔,制备了高滴度的特异性抗体(1∶4 896 )。本研究获得了纯化的Omp L17及其特异性抗体,为该外膜蛋白致病作用及免疫保护力研究奠定基础。

生物制剂和生物仿制药的特殊性及其风险管理

近年来,生物制剂发展迅速,临床广泛用于类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病、银屑病关节炎和系统性红斑狼疮等炎症疾病的治疗。作为一类新型药物,生物制剂具有某些特殊的风险(如免疫原性),并可引发一些严重感染、结核和机会性感染。最近几年,欧洲药品管理局(EMA)、世界卫生组织(WHO)和美国食品药品监督管理局(FDA)均颁布了有关生物制剂及生物仿制药临床试验和上市的相应法规与审批程序。本文分析了生物制剂和生物仿制药面临的用药风险及其特殊性。我国应借鉴欧美国家的经验,进一步规范生物制剂和生物仿制药的审批和评价体系,加强该类药物的用药风险监管。

Vero细胞森林脑炎疫苗毒种的选育及其生物学特性检测

目的选育Vero细胞森林脑炎疫苗适应毒种。方法将森林脑炎疫苗鼠脑病毒“森张”株在Vero细胞上连续传代适应,并对不同代次收获的病毒液的病毒滴度、免疫原性、稳定性等进行检测。结果“森张”株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8·5LgLD50/ml;免疫血清中和抗体效价高于1∶20,其它检测项目均符合疫苗生产用毒种的要求。结论Vero细胞适应的“森张”株毒种的初步特性显示可作为制备Vero细胞森林脑炎疫苗用毒种。

减毒沙门氏菌递呈的TGEVS／N融合基因疫苗的口服免疫原性

目的研究携带猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S/N融合基因的重组减毒沙门氏菌的口服免疫原性。方法将真核质粒pVAX-S/N电转化鼠伤寒减毒沙门氏菌SL7207,筛选获得疫苗菌株SL7207(pVAX-S/N)。将菌株SL7207(pVAX-S/N)及对照组SL7207(pVAX-S)以1×109 CFU/只灌胃免疫小鼠,测定免疫小鼠诱导的抗TGEV(和抗沙门氏菌均SL7207)的血清IgG及肠道粘膜IgA抗体动态水平,同时测定42d免疫小鼠的干扰素水平。结果菌株SL7207(pVAX-S/N)构建成功,首免后2～6周可诱导产生抗TGEV(和抗沙门氏菌SL7207)的血清IgG,第4～6周可诱导产生抗TGEV(和抗沙门氏菌均SL7207)的肠道粘膜IgA,SL7207(pVAX-S/N)诱导的IgG和IgA抗体最高滴度均略高于SL7207(pVAX-S),但差异不明显(P>0.05)。SL7207(pVAX-S/N)免疫42d小鼠诱导的干扰素浓度为659.45pg/mL,低于SL7207(pVAXD-S)组。结论 S/N融合基因疫苗SL7207(pVAX-S/N)具有良好的口服免疫原性,但与SL7207(pVAX-S)无明显差异。

从cDNA感染性克隆产生冷适应重配A型人流感病毒及免疫原性的初步研究

目的从cDNA感染性克隆产生冷适应重配A型人流感病毒株,并对其生物学特性和免疫原性进行初步测定。方法采用RT-PCR技术,分别扩增2006至2007年疫苗株A/New Caledonia/20/99的HA、NA全长基因片段,构建转录表达双向载体pMDV-A-HA、pMDV-A-NA,将这2个质粒与冷适应拯救系统的6个质粒共转染COS-1细胞,并对拯救的重配病毒的生物学特性和免疫原性进行初步鉴定。结果拯救出具有冷适应表型和温度敏感型的A型人流感弱毒株,初步测定了重配病毒的生物学特性和免疫原性。结论成功拯救具有冷适应和温度敏感表型的A型人流感弱毒株,并初步测定其免疫原性,为我国弱毒疫苗株的拯救和弱毒疫苗的发展奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒中和抗原表位基因的原核表达、纯化及免疫原性鉴定

为了获得具有免疫原性的猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要中和抗原表位(COE)蛋白及其多克隆抗体,试验对已发表的PEDV基因序列进行比对,并设计、合成COE编码基因(420 bp),将其克隆入原核表达载体pET-30a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,利用胶体金和Western-blot方法检测表达产物;纯化后免疫兔制备高免血清,并利用ELISA方法检测血清抗体效价。结果表明:表达的重组蛋白可与PEDV特异性抗体结合;免疫兔后获得的血清抗体效价达1∶6 400,具有免疫原性。

树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩IFNγ;经金属螯合柱复性及纯化,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IFNγ的分布情况。结果:构建了重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,重组蛋白在30℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h获得较高表达量,镍柱复性纯化后得到较高纯度的树鼩IFNγ。Western印迹显示IFNγ可与兔抗人IFNγ单克隆抗体特异性结合,应用Western印迹和ELISA分别检测树鼩IFNγ的免疫原性和抗体滴度,在树鼩的鼻、心、肝、肺、肾、气管中检测到IFNγ。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IFNγ,复性纯化后具有良好的免疫原性。

3种甲肝疫苗在儿童中应用的安全性及免疫效果观察

目的观察不同种类的甲型肝炎疫苗在儿童体内的接种反应及免疫效果。方法筛选2～3岁的甲肝易感儿童193人,分别接种进口灭活甲肝疫苗、国产灭活甲肝疫苗和国产冻干减毒甲肝疫苗,观察接种后48h内的局部反应和全身反应,并于完成免疫后1～2个月,采集血清标本检测抗-HAV-IgG抗体。结果193名观察对象在接种第1针和第2针后均未见严重不良反应,仅有4例出现轻微局部反应和全身反应。完成免疫接种后进口灭活甲肝疫苗、国产灭活甲肝疫苗和国产冻干减毒甲肝疫苗抗-HAV-IgG抗体阳转率分别为92.86%、67.61%和61.25%,GMT(ELASA法)平均滴度分别为1∶28.28、1∶53.39和1∶5.76。结论3种疫苗在儿童中的应用是安全的、有效的。

神经生长因子在不同条件下的活性研究

目的研究各种因素对神经生长因子(NGF)生物活性及免疫原性的影响。方法把天然NGF在不同浓度的变性剂、去污剂、氧化还原剂及其配伍中或在不同pH值、不同温度下进行孵育处理,测定其生物活性和免疫原性的变化。结果NGF在8mol/L尿素中孵育过夜后生物活性下降10倍,在浓度低于5mol/L的尿素中孵育过夜后生物活性基本不变;十二烷基硫酸钠和巯基乙醇对NGF生物活性破坏较大,且尿素可增加巯基乙醇的破坏作用;还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽配合使用对NGF生物活性的影响较小;NGF对温度敏感,在60℃孵育1h后活性降低约30倍,在37℃孵育48h生物活性开始下降;NGF在酸、碱中稳定。生物活性降低的NGF免疫原性未见明显改变。结论NGF的生物活性易受多种因素影响,但其免疫原性较稳定。

重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子栓在大鼠和Beagle犬中的免疫原性

目的在大鼠和Beagle犬阴道给予重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rhGM-CSF)栓3个月的长期毒性试验中,检测给药后动物血清中是否产生抗rhGM-CSF抗体和抗体的中和活性。方法 SD雌性大鼠设rhGM-CSF栓0(赋形剂对照组)、0.24、0.96和3.84 mg/kg 4个组;Beagle雌性Beagle犬设0(赋形剂对照组)、0.07、0.28和1.12 mg/kg 4个组。每天给药1次,连续3个月,恢复期1个月。间接ELISA法检测动物血清中抗rhGM-CSF的结合抗体,TF-1细胞/MTT比色法检测抗体的中和活性。结果①大鼠从给药1个月起至恢复期结束,3个剂量组动物血清中均能检测到抗rhGM-CSF的抗体;低剂量和中剂量2组间动物血清的抗体滴度差异无统计学意义,但与高剂量组相比低剂量组和中剂量组差异有统计学意义。体外测活法显示,各剂量组在给药1个月后有部分动物产生中和抗体;给药3个月或恢复期1个月时全部受检动物均产生中和抗体。②Beagle犬的各剂量组动物血清中均未检测到抗rhGM-CSF的抗体。结论 rhGM-CSF栓经阴道局部连续给予3个月的长期毒性试验中,啮齿类动物大鼠血清中各剂量组均产生抗rhGM-CSF的抗体,且抗体可中和GM-CSF的生物活性;而非啮齿类动物Beagle犬血清中则未检测到抗rhGM-CSF抗体。rhGM-CSF栓对大鼠具有免疫原性。

脐血间充质干细胞的培养鉴定及成骨诱导后的免疫原性研究

目的通过观察体外培养人脐血间充质干细胞(Umbilical cord blood-mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)并作诱导成骨分化,探讨其作为组织工程的骨种子细胞的可行性。方法体外分离培养UCB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达及其变化规律;体外成骨诱导UCB-MSCs2周,采用Alizarin Red染色和钙离子半定量测定的方法评价细胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs细胞,流式细胞仪检测加入IFN-γ前后的HLA-Ι、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表达情况;流式细胞仪检测UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况以观察成骨诱导分化的MSCs免疫抗原性的变化。结果第1、3、5代细胞的CD29、CD105和CD166均呈阳性表达,而造血细胞系的表面标记CD31、CD34和CD45则呈低表达,且随传代次数增加含量逐渐下降。UCB-MSCs成骨诱导2周后,Alizarin Red染色为阳性。对照组则无明显钙盐沉积。钙离子半定量的检测结果则表明,UCB-MSCs成骨诱导2周后的钙离子含量远高于未诱导组。流式细胞检测结果显示,人UCB-MSCs高表达HLA-Ι类分子,不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40,CD80等共刺激分子;经IFN-γ刺激诱导后,HLA-Ι类分子的表达未发生改变,HLA-Ⅱ类分子呈阳性表达,而CD40和CD80的表达仍为阴性。人UCB-MSCs在成骨诱导分化前后HLA-Ι类分子均为阳性表达;而HLA-Ⅱ类分子在成骨分化前为阴性,诱导后阳性表达率增高。结论①UCB-MSCs能诱导分化为成骨细胞,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞;②成骨分化使UCB-MSCs的免疫原性发生相应变化。

聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学研究

目的研究聚乙二醇化重组人生长激素的免疫原性及药动学。方法用rhGH及其两种mPEG修饰物PGH1、PGH2免疫家兔,检测兔血清中的抗体滴度;对家兔单次背部皮下给药,定时取血清,建立rhGH及其修饰物的ELISA双抗夹心检测法,检测血清中的药物浓度,并计算药动学参数。结果经过mPEG修饰后,明显降低了rhGH的抗体滴度,缩短了抗体持续时间。在药动学研究中发现,其t1/2β从3.1h显著延长到PGH1的9.9h和PGH2的22.5h,其AUC也有很大的提高。结论mPEG修饰后可明显降低rhGH的免疫原性,延长药物在动物体内的半衰期,降低清除率,改善其药动学性质。且改善程度随mPEG相对分子质量的增大而增强。

伤寒结合疫苗免疫原性和动物安全性研究

伤寒V i多糖与白喉类毒素(DT)蛋白以己二酰肼(ADH)作连接臂,在碳二亚胺(EDAC)的作用下结合成V i-DT结合物,进行抗原性、免疫原性和动物安全性试验。结果显示,3批结合物抗体阳转率均为100%,加强免疫一针后GMT值明显升高(p<0.001),免疫剂量以0.75μg/只抗体增长最为明显,甚至以低剂量0.375μg/只仍能获得较高的抗体滴度,多项动物试验证明该结合物是安全的。显示V i-DT结合物有很好的动物安全性和免疫原性,为临床试验提供实验室依据。

流行性感冒病毒裂解疫苗在18岁以上健康人群中应用的安全性及免疫原性研究

目的 评价流感病毒裂解疫苗安尔来福（R）的免疫原性及安全性.方法 2010年8-9月在沈阳市开展开放式临床试验,选择18～60岁及＞60岁健康成年人接种安尔来福（R）进行安全性观察,并采集受试者免疫前及免疫后21 d 血清标本,采用血凝抑制试验（HI）进行流感病毒裂解疫苗甲型H1N1、甲型H3N2及乙型3个型别抗体检测.结果 130名观察对象完成疫苗接种并进行安全性观察,其中120人完成免疫前及免疫后采血.总体不良反应发生率为2.3%（3/130）,均为全身不良反应,未出现严重不良反应.接种疫苗后21 d,成年组甲型H1N1、甲型H3N2及乙型3个型别抗体阳转率分别为82.5%、93.7%、92.1%,GMT增长倍数分别为20.2、32.0、11.4,保护率分别为92.1%、98.4%、98.4%;老年组3个型别抗体阳转率分别为89.5%、91.2%、87.7%,GMT增长倍数分别为23.9、39.8、15.1,保护率分别为93.0%、94.7%、96.5%.结论 疫苗安尔来福（R）接种后甲型H1N1、甲型H3N2及乙型3个型别抗体各项指标均超过欧盟标准,表明其免疫原性及安全性良好.