Importin 8在成骨分化中的细胞内定位及表达差异

目的观察Importin 8(IPO8)在成骨分化过程中的细胞内定位与表达差异。方法对人成骨样SaOS-2细胞进行成骨诱导分化,采用茜素红染色、免疫细胞化学方法和实时定量PCR技术检测成骨分化效果及分化过程中IPO8的细胞内定位和表达差异。结果茜素红染色显示SaOS-2细胞成骨诱导第10天可见大量红色结节样结构。免疫细胞化学方法显示,IPO8主要定位于细胞核周胞质。诱导至第3天,IPO8胞浆胞核均有表达,但明显开始向核内移动。至第7天,核内表达更明显,而到第10天,细胞呈骨细胞样,IPO8均匀分布于胞质内。实时定量PCR技术检测发现,OPN基因在SaOS-2细胞成骨分化过程中表达增加,而IPO8基因在成骨分化至第3天时表达最高,之后呈下降趋势。结论 IPO8在成骨分化过程中的细胞内定位与表达存在明显差异,提示IPO8可能参与成骨细胞分化过程的调控。

IPO8基因启动子区rs35100176位点变异对基因表达的影响

目的:研究人importin 8(IPO8)基因启动子区rs35100176多态性位点CCT插入/缺失对基因表达的影响。方法:PCR扩增IPO8基因启动子区包含rs35100176多态位点的342 bp序列,通过测序获得了49例DNA样本的基因多态性分布。以CCT/CCT插入纯合子或-/-缺失纯合子DNA样本为模板,扩增含有不同插入/缺失序列的IPO8基因启动子片段,插入萤光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重组表达载体。重组质粒经Fugene 6.0转染入细胞,采用双萤光素酶报告系统,检测携带不同多态性序列的重组质粒中报告基因的表达活性;real-time PCR检测各不同基因型细胞中IPO8 mRNA表达。结果:通过测序发现rs35100176多态位点存在CCT/CCT、CCT/-和-/-3种表型,其基因分布频率分别为18.37%、55.10%和26.53%。成功构建pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,pGL3-3N Insertion启动下游报告基因表达的相对活性与pGL3-3N Deletion相比显著减弱,两者存在显著差异(P<0.05);real-time PCR结果显示,CCT纯合插入的HEK293细胞中IPO8 mRNA的表达显著低于CCT纯合缺失的Saos-2细胞。结论:IPO8基因启动子区rs35100176位点的CCT碱基插入变异能显著抑制启动子活性,从而影响IPO8基因的转录。

人Importin8基因真核表达载体的构建及表达

目的克隆人Importin8（IP08）基因，观察IP08与绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体融合蛋白在宫颈癌细胞HeLa内的表达和定位。方法以HeLa细胞总RNA为模板进行逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR），扩增全长IP08编码序列，经HindIll和XbaI双酶切后，插入GFP质粒pEGFP—C1．，构建pEGFP-IP08重组表达载体。瞬时转染重组质粒入HeLa细胞，荧光显微镜观察pEGFP．IP08在细胞内的表达与定位。结果测序结果显示经PCR扩增的IP08编码序列完全正确，酶切显示重组质粒pEGFP—IP08构建成功，荧光显微镜显示融合蛋白GFP—IP08主要在细胞核内分布。结论成功克隆IP08基因并构建真核表达载体，证实GFP—IP08蛋白主要定位于HeLa细胞核。