胎牛血清在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用研究

【目的】研究胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)在猪孤雌囊胚玻璃化冷冻后恢复培养中的作用。【方法】本试验以体外培养第5天的猪孤雌激活囊胚为材料,将新鲜和冷冻囊胚分别在含10%FBS(V/V)的胚胎培养液中继续培养48 h,即分为新鲜组(Fresh)、新鲜+FBS组(Fresh+FBS)、冷冻组(Vitrified)、冷冻+FBS组(Vitrified+FBS)。观察各组囊胚的扩张和孵化能力,检测胚胎的细胞膜损伤、凋亡细胞数目、总细胞数目、胞内活性氧(ROS)水平、线粒体活性以及发育相关基因的表达水平。【结果】与Fresh和Vitrified组相比,Fresh+FBS和Vitrified+FBS组的完全扩张率、孵化率和囊胚细胞总数均显著提高(P<0.05),细胞膜损伤率和细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)。与Fresh组相比,Vitrified组ROS水平显著升高(P<0.05),Fresh+FBS和Vitrified+FBS组ROS水平均显著降低(P<0.05)。Vitrified+FBS组的线粒体活性显著高于Vitrified组(P<0.05)、显著低于Fresh+FBS组(P<0.05),与Fresh组无显著差异(P>0.05)。相比于Fresh组,Vitrified组POU结构域与类转录因子1(POU5F1)表达水平显著上升(P<0.05)、过氧化氢酶(CAT)表达水平显著下降(P<0.05)。增殖细胞核抗原(PCNA)、DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、BCL2相关X蛋白(BAX)/BCL2L1的表达水平在Fresh和Vitrified组之间均无显著性差异(P>0.05)。Fresh+FBS和Vitrified+FBS组中PCNA、SOD 1和CAT的表达水平显著高于Fresh和Vitrified组(P<0.05)。【结论】体外培养第5天的新鲜和冷冻猪孤雌囊胚在10%FBS中继续培养,其发育能力及胚胎质量均得到明显改善。

脱防冻剂方法对牛体外受精胚胎冷冻后成活率的影响

为了观察脱防冻剂方法对牛体外受精冷冻胚胎在体内、外发育率的影响，应用常规冷冻法在０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇溶液中冷冻受精后７、８ｄ的囊胚，解冻后在０．２５、０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步或在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中三步脱防冻剂的胚胎孵化率（分别为６８．６％、６２．２％、６８．７％）与用ＰＢＳ／ＦＣＳ六步脱防冻剂的差异不显著（７０．４％，Ｐ＞０．０５），但在０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中三步脱防冻剂后，孵化率显著降低（４７．６％，Ｐ＜０．０１）。用０．２５ｍｏｌ／Ｌ或０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖或海藻糖预先使胚胎脱水后冷冻，解冻后可使胚胎直接在ＰＢＳ中一步脱掉防冻剂，胚胎孵化率（４５．０％～４９．５％）与在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步脱防冻剂的相似（５１．５％，Ｐ＞０．０５）。移植试验表明，在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液中二步脱防冻剂获得的妊娠率与六步脱防冻剂相似，与在ＰＢＳ中一步脱防冻剂的亦无明显差异，但妊娠率均偏低（２１．４％～３７．５％）。

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。

不同培养基对牛体外受精胚发育率及抗冻性的影响

采用M199、SOFaa(aa:Amino Acid)和SOF对牛体外受精卵进行发育培养,比较了三种培养条件下的囊胚发育率、孵化率以及这三种条件下培养出来的囊胚的抗冻能力。在M199和SOFaa处理组,囊胚发育率分别为22.6％和29.0％,孵化率分别为 11.3％和8.1％,两者间无显著差异,但均极显著高于SOF处理组(13.6％,0,P<0.01)。三个处理组的囊胚经冷冻解冻后的存活率分别为78.5％、46.4％和17.3％,孵化率分别为41.9％、23.2％和0,三者间存在极显著差异(P < 0.01)。结果表明,不同的培养液不但影响胚胎发育率,同时也影响胚胎的抗冻能力,M199的培养效果优于SOF,氨基酸能明显提高胚胎发育率及抗冻能力。

牛体内、外受精胚胎玻璃化冷冻保存技术的研究初报

利用 3种培养液即输卵管合成液 (SOF)、TCM199和CR1aa对牛体外受精后的卵母细胞进行培养 ,结果卵裂率分别达 85 %、67%和 72 % ,囊胚发育率分别为 37%、2 1%和 30 %。对所获得的囊胚利用EFS玻璃化溶液进行冷冻保存。在 10 %EG中预处理 5min后再移入EFS 4 0平衡 30s二步法冷冻保存的胚胎 ,其解冻后继续发育率高达 86% ,与对照组 91%相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而EFS 30二步法冷冻保存的胚胎发育率仅为 4 3% ,与对照组相比差异极显著 (P <0 .0 1)。体内受精早期囊胚用EFS 4 0一步法和二步法冷冻保存后的继续发育率分别为 83%和 95 % ,与对照组(97% )相比均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。

OPS法玻璃化冷冻牛卵母细胞和囊胚

本文报道了利用拉细开口型细管 (Open Pulled Straw,OPS)方法进行玻璃化冷冻保存体外成熟(IVM)的牛卵母细胞及体外生产 (IVP)的牛囊胚的实验结果。实验 1的牛卵母细胞冷冻处理分 2组 ,组 1(G1 )是将卵母细胞在 IVM2 1 h时去除部分卵丘细胞后马上进行冷冻处理。组 2 (G2 )卵母细胞在 IVM6h时去除部分卵丘细胞 ,然后继续培养至 2 2 h冷冻 ;冷冻后的卵母细胞在液氮中保存 0 .5～ 2 h后解冻再继续 IVM1 h后与正常 IVM2 4h的对照组卵母细胞一起进行体外受精 (IVF)处理。实验 2则冷冻了来自IVP的 6、 7日龄的牛囊胚。结果显示 ,G1的卵母细胞 IVF后 8d的囊胚率 (2 2 .8% ,2 6/1 1 4)和孵化囊胚率 (1 4.9% ,1 7/1 1 4)都极显著地高于 G2 (分别为 2 .9% ,5 /1 71和 0 .5 % ,1 /1 71 ,P<0 .0 0 1 ) ;但两处理组的受精卵裂率差别不大 (分别为 48.2 %和 41 .5 % ,P>0 .3 )。冷冻第 6d和第 7d的体外囊胚 ,其冻后存活率和囊胚孵化率分别为 92 .7%、 89.2 %和 83 .6%、 66.7%。结果表明 ,利用

处理方式不同的颗粒细胞和卵泡液对牛卵母细胞体外受精后卵裂率和囊胚率的影响

将牛的卵母细胞置于添加有不同预处理颗粒细胞及含有卵泡液的培养液或不含有卵泡液的培养液中进行体外成熟、受精及胚胎发育培养, 研究了颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对牛卵母细胞成熟、受精后卵裂率、囊胚率的影响。 2178 枚卵母细胞体外成熟受精后胚胎发育的对比观察结果表明: 颗粒细胞、卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对卵母细胞成熟受精后胚胎的卵裂具有显著影响 (P<0.05); 颗粒细胞对囊胚的发育有显著影响 (P<0.05); 卵泡液及颗粒细胞与卵泡液交互作用对囊胚的发育无显著影响 (P>0.05)。不同因素对卵裂率、囊胚率的影响表现为: 颗粒细胞因素﹥培养液因素﹥培养液×颗粒细胞交互作用。结论: TCM199 培养液中添加卵泡液和单层颗粒细胞组成的培养系统用于牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的效果较好。共培养体系中的单层颗粒细胞用经酶消化分散处理后在培养箱中孵育 10min 的颗粒细胞替代时, 胚胎的发育效果并不受影响。

平衡方法及平衡和解冻温度对牛体外受精胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

以体外成熟、体外受精并体外发育的牛囊胚为实验材料进行玻璃化冷冻保存，分别探讨了防冻剂的平衡方法以及平衡和解冻温度对胚胎冷冻效果的影响．实验结果显示，在室温下（１８℃）以二步法或三步法添加防冻剂的冷冻效果，明显优于在４℃下，以二步法添加防冻剂的效果，其冷冻—解冻胚的发育率分别为６２．８％（５９／９４）、５３．１％（５２／９８）和１４．６％（１２／８２）（Ｐ＜０．０１）；另外，室温下以二步法玻璃化冷冻的胚胎，在２０℃水浴中解冻的发育率明显高于３７℃解冻的效果，６２．７％（３７／６２）、２６．２％（１６／６１）（Ｐ＜０．０１）．结果表明：体外成熟、体外受精的牛胚胎可以进行玻璃化冷冻保存，并能得到较高的培养存活率，在室温下，以二步法添加防冻剂，并于２０℃下解冻的玻璃化冷冻保存方法是一种快速、简便而有效的方法．

不同来源牛体外胚胎与牛子宫内膜细胞共培养体系的建立

为了初步建立有效的牛胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系。本实验分别将体外受精第7天后的胚胎和孤雌激活,与培养7天的胚胎与子宫内膜细胞共培养,在48、72h后分别统计体外受精实验组和孤雌激活实验组的孵化率。实验结果表明:在本实验室培养条件下,在与子宫内膜细胞共培养48h后,体外受精胚胎和孤雌发育胚胎在孵化率上存在显著差异(40±5)%、(25±5)%,(P<0.05);与子宫内膜共培养72h后,孵化率无显著差异(70±8.66)%,(65±5)%,(P>0.05)。本实验证明了在体外环境下,牛体外胚胎与子宫内膜细胞共培养后能够正常孵化,可以初步建立起牛体外胚胎与子宫内膜细胞的体外共培养体系,并为进一步研究该体系对牛体外胚胎培养质量的影响奠定一些基础。

牛体外受精胚的发育速度和染色体研究

利用不同个体的牛冷冻精液对屠宰场废弃牛卵巢内卵母细胞进行体外受精,对体外受精胚胎的发育速度和染色体的异常发生进行了研究。结果显示,冷冻精液A组体外受精48h后的卵裂率显著高于冷冻精液B组(P<0.05),2组之间的囊胚形成率差异显著(P<0.05);冷冻精液A体外受精后的胚胎发育速度显著快于冷冻精液B组(P<0.05);染色体分析结果表明,2组胚胎染色体异常发生率无显著差异,异常胚胎均表现为多倍体的发生率较高。

不同浓度CO_2对牛卵母细胞体外成熟和受精的影响

对牛卵巢卵泡内卵母细胞在不同浓度的CO2培养箱内体外成熟、体外受精后的卵裂率及胚胎体外发育进行了研究。结果显示,含5%小牛血清(CS)的TCM-199内的卵母细胞在2%CO2条件下培养20h后,达到第二次减数分裂期(MⅡ期)的卵子数明显高于在5%CO2条件下培养的卵母细胞数(P<0.05)。两种浓度的CO2条件下培养的牛卵母细胞体外受精后的卵裂率无明显差异,2%CO2浓度下培养的卵母细胞的囊胚发育率高于5%CO2浓度下培养的卵母细胞。

受精滴中精子不同平衡时间对牛卵母细胞体外受精的影响

为寻找精子在受精滴中的最佳平衡时间， 以加入精子时间为０ ｈ （对照组）， 分别在０ｈ， ０．５ ｈ， １ ｈ， ２ ｈ， ４ ｈ 随机加入等数卵母细胞到各受精滴， 结果显示： ０ ｈ， ０．５ ｈ 组卵裂率较高， 分别为８７．７％ 、８４．７％ ， 与其他组相比差异显著（ Ｐ＜ ０．０１）； ０．５ｈ 组的囊胚率最高，为６７．５％ ，与对照组的５７．７％ 比较差异显著（ Ｐ＜ ０．０１）。结果表明，受精滴中精子经过０．５ｈ 平衡后， 弱精及死精粘聚沉淀， 余下活力强的健壮精子， 此时加入牛卵母细胞受精，

在不同溶液和容器中短期保存牛体外受精胚胎的效果

为提高室温保存牛体外受精胚胎的效果，特进行了３个试验。试验一分别用３种保存液（ＰＢ１，ＴＣＭ－１９９，Ｈａｍ′ｓＦ－１０）、两种容器（玻璃试管，ＡＡ２０１塑料细管）在２０℃保存胚胎２４ｈ。结果表明，保存液对保存效果无显著影响，在３种保存液中保存第７、８天囊胚的总孵化率分别为７４．７％，７１．８％，７５．５％（Ｐ＞０．０５）。用试管保存的胚胎总孵化率（８３．６％）明显优于用ＡＡ２０１塑料细管保存的（６０．８％）（Ｐ＜０．０１）。试验二比较了用ＰＢ１在两种型号的细管（ＡＡ２０１，ＺＡ４７５）中保存胚胎的效果。胚胎在ＺＡ４７５细管中保存后的孵化率（８９．４％）显著高于在ＡＡ２０１细管中保存的（７６．３％）（Ｐ＜０．０１）。试验三用ＰＢ１在ＺＡ４７５细管中保存第７天囊胚３～７ｈ或１８～２４ｈ，将１枚胚胎移入已授精的、处于发情周期第７天的受体母牛黄体对侧的子宫角内。两组受体牛的妊娠率（分别为６０．３％，６８．３％）和双胎率（分别为４５．７％，６９．８％）均较高，而且差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明胚胎可在ＺＡ４７５细管中成功地保存２４ｈ。

不同来源牛囊胚IFN-τ分泌水平的比较

干扰素-tau(IFN-)τ在妊娠建立中有重要生物学功能,对提高体外胚胎移植成功率有重要意义。为了探明不同来源的牛囊胚分泌的IFN-τ水平,本实验用细胞病变抑制法对牛孤雌发育(PA)、体外受精(IVF)、体外受精冷冻解冻(FT-IVF)及体细胞核移植(SC N T)等4种囊胚进行了检测。结果表明:在C R 1aa体系中培养7 d的PA、IVF、FT-IVF囊胚分泌的IFN-τ量没有显著性差异(P>0.05),但它们都显著高于相同日龄SC N T囊胚的分泌量(P<0.05)。分别在C R 1aa和SO FaaBSA体系中生产的PA囊胚分泌的IFN-τ量没有显著性差异(P>0.05),即2种体系对牛孤雌发育囊胚分泌IFN-τ量没有影响。在C R 1aa培养体系中生产的PA和IVF囊胚分泌的IFN-τ量与囊胚细胞数均无相关性。PA囊胚分泌的IFN-τ与囊胚直径平方无相关性,IVF囊胚的IFN-τ的分泌量与囊胚直径平方中等相关。

牛老化卵体外受精后的胚胎发育速度与细胞遗传学研究

体外成熟培养的牛老化卵受精后发育到囊胚期速度减慢。囊胚期的发育率分别为 2 2h培养组为 35 .3% ,34h组 2 3.6 % ,4 6h组 15 .4 % ,胚胎的发育速度随培养时间的延长而明显减慢 (P <0 .0 5 )。 4 6h组的囊胚期胚胎的平均卵裂球数明显少于 2 2h组 (P <0 .0 5 ) ,老化组的染色体平均分裂像、分裂指数均明显低于对照组 (P <0 .0 5 )。染色体异常发生率 4 6h组高于 2

牛体内囊胚全转录组模式解析

旨在解析牛体内囊胚的全转录组模式。本研究选择3头15月龄以上、健康状况良好的泌乳奶牛,采用超排获得体内囊胚,采用单细胞全转录组测序技术检测囊胚mRNA、lncRNA、circRNA转录模式,并采用生物信息学工具对其进行分析。试验获得牛体内囊胚约19975个mRNAs、12715个novel lncRNAs及887个circRNAs。mRNA有12种可变剪切方法,以转录起始区域可变剪切(TSS)为主。采用基因本体(GO)和相关信号通路(KEGG)对其分析发现,生物功能主要富集在新陈代谢、细胞膜和蛋白结合、细胞通讯、细胞组织成分、生长发育等功能,Pathway主要富集在细胞周期、膜运输、染色体组织调控等通路;circRNA有6种类型,其中CLASSIC类型circRNA数量最多,这种剪切方式会形成成环的外显子circRNA(EcircRNA)。本研究阐明了牛体内囊胚的全转录组模式,为全面了解牛体内囊胚提供了新的思路。

不同因素对牛IVF胚胎体外发育影响的研究

为进一步完善牛胚胎体外发育体系,以体外受精胚胎为研究对象,对精子获能液、胚胎培养液、培养液中胎牛血清与BSA的添加浓度、卵丘细胞共培养等影响体外胚胎发育体系的各个因素进行筛选优化。结果表明:BO获能液比普通获能液能够获得更高的卵裂率;添加葡萄糖、BSA以及不同浓度胎牛血清的牛胚胎培养液比未添加组有更好的发育效果,卵裂率、囊胚率分别达到(79.85±0.74)%、(28.69±1.45)%;在此基础上,利用牛卵丘细胞与牛胚胎共培养,将囊胚率进一步提高至(32.70±1.73)%,并用免疫荧光染色验证其卵丘细胞未发生凋亡。本研究进一步优化了牛胚胎体外发育体系,提高了体外胚胎的囊胚发育率。

催乳素和牛卵泡液对胚胎体外成熟及未成熟的牛卵母细胞的影响(英文)

对催乳素和牛卵泡液在水牛卵母细胞体外成熟中的作用进行了探讨.来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在含体积分数为5%CO2的培养箱中培养24～26h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力.实验1在成熟液中添加1 0μg/mL催乳素(PRL),卵母细胞的囊胚发育比例(12 8%)比对照组(9 1%)高但不显著.实验2添加5%牛卵泡液(BFF),卵母细胞卵裂的比例明显高于对照组,但囊胚形成率则几乎一样;添加1 0μg/mLPRL和5%BFF组卵母细胞卵裂的比例为38 1%,而发育成囊胚阶段的卵母细胞的比例为14%.试验结果表明:添加适宜浓度的BFF和PRL能促进未成熟的水牛卵母细胞体外成熟后的胚胎发育能力.

牛滋养层干细胞样细胞系的建立

为了成功建立牛滋养层干细胞样细胞系,探讨牛滋养层干细胞样细胞(Bovine Trophoblastic Stem-like Cells)体外培养条件及相关影响因素,以胎牛子宫成纤维细胞条件培养液作为培养基,胶原铺被培养皿,利用体外受精牛囊胚培养得到牛滋养层干细胞样细胞,并调整培养体系,以探讨其最适生长条件。结果表明:利用添加FBS、β-巯基乙醇、肝素以及胎牛子宫成纤维细胞条件培养液的DMEM/F12,体外培养牛囊胚,可以初步建立牛滋养层干细胞样细胞系。

牛体内囊胚经体外共培养诱导子宫内膜上皮细胞整合素αv,β3基因差异的表达

目的利用牛体内胚胎与其子宫内膜上皮细胞体外共培养的方式,探究共培养前、后子宫内膜上皮细胞中整合素αv,β3基因差异表达的变化,为今后建立快捷有效的牛子宫容受态预判方法提供参考。方法将体内冲出的牛囊胚与原代培养并传代纯化至第5代的牛子宫内膜上皮细胞进行24 h体外共培养,利用RT-PCR技术对共培养前、后的子宫内膜上皮细胞进行αv,β3基因的表达检测。结果 RT-PCR检测结果显示,共培养前、后均有整合素αv,β3的表达;共培养I组(囊胚组),其共培养后诱导整合素αv,β3基因的表达与未共培养对照组二者之间差异无显著性(P>0.05);共培养II组(孵化囊胚组),其共培养后整合素αv,β3基因的表达显著高于对照组和共培养I组(P<0.05)。结论牛体内孵化囊胚经体外共培养诱导牛子宫内膜上皮细胞表达整合素αv,β3的效果,明显优于早期囊胚;整合素αv,β3基因具有作为牛子宫容受态体外检测标志的潜力。