ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS信号通路可抑制异基因反应性T淋巴细胞的功能

本研究探讨ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS-B7h信号通路对异基因反应性T淋巴细胞的作用和机制。建立稳定高表达ICOS-Ig的CHO细胞株,培养制备纯化的ICOS-Ig融合蛋白;以C57BL/6小鼠脾脏来源的CD4+淋巴细胞为反应细胞,BABL/C骨髓源成熟树突状细胞为刺激细胞,应用不同浓度梯度的ICOS-Ig干预,以相同浓度的人Ig作为对照。结果显示:获得的目标蛋白的分子量为54kD,内毒素含量<10EU/ml。ICOS-Ig在≥10μg/ml时可显著减少DC刺激引起的异基因反应性T淋巴细胞的增殖效应(p<0.01)。ICOS-Ig不影响T淋巴细胞的活化,ICOS-Ig浓度与CD4+ T淋巴细胞的凋亡成正相关。单纯刺激组、ICOS-Ig10μg/ml和20μg/ml干预组的CD4+Annexin V+PI-细胞群的频率分别为15.1%、26.4%和33.6%。ICOS-Ig作用后,Th1细胞因子TNFα分泌降低,Th2细胞因子IL-4分泌增加。结论:ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS通路可明显减弱异基因反应性T淋巴细胞的增殖反应,并改变Th细胞的极化,对CD4+ T淋巴细胞的活化无影响,但可促进活化的T淋巴细胞凋亡。

共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在骨性关节炎滑膜组织中的表达及其临床意义研究

目的研究共刺激分子(ICOS)及其特异性配体(ICOSL)在膝关节骨性关节炎(OA)滑膜组织中的表达及其临床意义。方法分别采集14例OA轻度及18例OA重度患者滑膜病变部位和远离病变部位,经HE染色法观察其病理改变,免疫组织化学法检测滑膜组织中ICOS、ICOSL的表达情况。结果 OA轻度患病组和重度患病组滑膜组织病变部位出现明显的炎性改变。ICOS、ICOSL在OA患者病变滑膜组织中高表达,且重度患病组表达最高。结论 ICOS、ICOSL共刺激分子在OA患者病变滑膜组织中高表达,对炎症反应的免疫紊乱和免疫损伤发挥重要作用。

干扰素α-1b联合替比夫定序贯治疗慢性乙型肝炎的疗效及其对患者sPD-1和sICOS水平的影响

目的观察干扰素α-1b(IFNα-1b)联合替比夫定序贯治疗乙型肝炎的疗效,并探讨其对患者血清中可溶性程序性死亡蛋白1(s PD-1)和可溶性可诱导共刺激分子(s ICOS)水平的影响。方法选取我院2012年1月至2013年5月符合条件的患者80例,按随机数表法随机分为观察组和对照组,每组40例。两组患者均给予IFNα-1b治疗,50 g/次,隔日1次,肌内注射。对照组继续给予IFNα-1b巩固治疗,用量同前,疗程12个月。观察组口服替比夫定序贯治疗,600 mg/次,1次/d,疗程12个月。比较两组患者治疗后的应答有效率以及治疗前后的血清s PD-1和s ICOS水平,检测两组患者的门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及γ-谷氨酸酰基转移酶(GGT),并参照慢性肝病量表(CLDQ)评价生活质量。结果观察组患者的完全应答率和部分应答率分别为50.0%(20/40)和37.5%(15/40),均高于对照组的40.0%(16/40)和25.0%(10/40),差异均有统计学意义(P<0.05);观察组患者治疗后的CLDQ量表各项评分均明显高于对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);观察组治疗后AST[(26.56±2.85)U/L]、ALT[(30.28±3.23)U/L]和GGT[(34.26±3.58)U/L]水平均显著低于对照组(P<0.01);观察组治疗后血清中s PD-1和s ICOS水平分别为(404.27±41.26)pg/m L和(35.78±3.91)pg/m L,均明显低于对照组的(517.91±52.55)pg/m L和(44.36±4.56)pg/m L,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。结论 IFNα-1b联合替比夫定序贯治疗乙型肝炎可明显改善患者生活质量,提高应答总有效率,其抑制患者血清中s PD-1和s ICOS水平表达可能在治疗中发挥重要作用。

运动对ICOS的诱导表达作用及其生物学功能研究

目的:立足于运动训练对运动员免疫功能的影响,就运动对ICOS分子表达的诱导作用及其生物学功能做一探索性研究。方法:随机抽取17～23岁运动员共35名为实验对象,建立人体运动免疫研究实验模型;运用密度梯度细胞分离法,获得运动员运动前、期间、运动后不同时段的外周血PBMC;运用细胞体外培养技术、MTT法和流式细胞术、RT-PCR技术,体外检测各时段T细胞活化增殖程度、T细胞亚群变化及T细胞表面ICOS及T细胞ICOS mRNA表达水平;将ICOS特异性配体GL-50与上调表达ICOS分子的T细胞体外共育,5天后ELISA法检测细胞培养液中IL-10水平,同时检测运动员运动前后血清IL-10、LI-2、IFN-γ水平。结果:运动可激发T细胞活化增殖,导致T细胞亚群变化;运动可诱导活化T细胞上调表达ICOS和ICOSmRNA;ICOS/GL50共刺激信号可刺激T细胞合成分泌IL-10;持续4用运动训练后,运动员血浆IL-10水平显著提高,IL-2、IFN-γ水平明显下降。结论:长期运动应激可诱导活化T细胞上调表达ICOS分子;ICOS分子具有加强T细胞合成分泌IL-10、诱导Th2细胞增殖分化的重要功能;ICOS/GL50共刺激信号诱导IL-10分泌、Th1/Th2失衡,是运动后机体对感染性疾病易感性增高的"运动性免疫抑制"现象的重要免疫学基础。

Graves病外周血CD4^(+)T细胞ICOS及CD19^(+)B细胞ICOSL高表达且与促甲状腺素受体抗体(TRAb)水平正相关

目的探索诱导性共刺激分子及配体(ICOS/ICOSL)在Graves病(GD)外周血淋巴细胞上的表达及临床意义。方法募集105例初发未治疗的GD甲亢患者纳入初发GD甲亢组,匹配同时期性别、年龄无差异的健康对照组67例。其中初发GD甲亢组有19例患者接受抗甲状腺药物治疗并在门诊规律随访直至TRAb转阴,以动态观察ICOS、ICOSL在治疗前后的变化。分离初发GD甲亢患者外周血单个核细胞(PBMC),PCR检测PBMC上ICOS、ICOSL mRNA的表达;流式细胞术分别检测CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞亚群表面ICOS及CD19^(+)B淋巴细胞表面ICOSL的表达,分析其与甲状腺功能及促甲状腺素受体抗体(TRAb)水平的相关性。动态观察GD甲亢患者治疗前后ICOS、ICOSL表达的变化。结果与健康对照组相比,初发GD甲亢组PBMC上ICOS及ICOSL mRNA表达水平均显著增加。初发GD甲亢组CD4^(+)T细胞表面ICOS表达水平升高,且与游离甲状腺三碘原氨酸(FT3)水平显著正相关;TRAb高滴度组CD19+B细胞表面ICOSL表达水平显著高于TRAb低滴度组;GD甲亢患者TRAb转阴后,CD4^(+)T细胞表面ICOS及CD19+B细胞表面ICOSL的表达水平较初发时显著下降。结论Graves病患者外周血CD4^(+)T细胞表面ICOS及CD19+B细胞表面ICOSL表达水平显著升高;随着TRAb水平降低,CD4^(+)T细胞表面ICOS及CD19+B细胞表面ICOSL表达水平有所恢复。

白塞病患者外周血CD4^+和CD8^+ T细胞上ICOS与CD28共表达水平及与疾病的关系

目的研究白塞病(Behcet’s disease,BD)患者外周血CD4^+T细胞和CD8^+T细胞上ICOS(inducible costimulatory molecule,ICOS)与CD28共表达水平及与疾病的关系。方法采用流式细胞术检测BD患者(n=22),包括BD活动期(active BD,ABD)患者(n=14)和BD稳定期(stable BD,SBD)患者(n=8),以及健康体检者(n=22)外周血CD4^+T细胞及CD8^+T细胞上ICOS与CD28共表达水平。结果 ABD患者外周血CD28^+ICOS^+CD4^+T细胞的比例较正常对照明显上升[(34.72±12.87)%vs.(25.36±8.24)%,P<0.05],CD28^+ICOS^+CD8^+T细胞的比例与正常对照相比无明显改变[(9.32±4.57)%vs.(7.24±3.36)%,P>0.05];ABD患者外周血CD28^-ICOS^+CD4^+T细胞的比例较正常对照明显升高[(2.54±1.63)%vs.(0.76±0.25)%,P<0.05];ABD患者CD28^-ICOS^+CD8^+T细胞的比例较正常对照也明显升高[(8.79±3.41)%vs.(3.04±1.25)%,P<0.05]。结论 ICOS在BD患者外周血T细胞亚群中表达水平的增高在一定程度上独立于CD28分子,提示患者体内仅表达ICOS分子的细胞同样也可能在发病过程中发挥重要作用,为BD的治疗提供了相应的理论依据。

类风湿性关节炎患者外周血CD3^+CD8^+效应记忆T细胞和滤泡辅助性T细胞ICOS、 PD-1表达上调且与病情相关

目的研究类风湿性关节炎(RA)患者外周血T淋巴细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)和可诱导共刺激分子(ICOS)的表达,并确定其与疾病活动度之间的关系。方法募集RA患者30例、健康对照26例。流式细胞术检测外周血CD3^+CD8^+的效应记忆T细胞(Tem)和滤泡辅助性T(Tfh)细胞比例,而后检测淋巴细胞亚群中PD-1和ICOS阳性的细胞比例;通过Spearman相关性分析评估其与28个关节疾病活动度评分(DAS28)之间的相关性。结果与健康对照组相比, RA组患者外周血Tem和Tfh细胞绝对数增高, Tem和Tfh细胞的ICOS与PD-1表达增加;RA组患者外周血CD3^+CD8^+ Tem和Tfh细胞ICOS和PD-1表达水平与DAS28之间呈正相关。结论外周血CD3^+CD8^+ Tem和Tfh细胞PD-1和ICOS可能参与RA的发生发展,并可能作为RA活动度的评价指标。

人ICOS基因转染细胞对抗体产生的影响

利用RT-PCR方法从扁桃体中激活的T细胞,mRNA中扩增出ICOS cDNA,继而将ICOS基因插入到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,用脂质体法将重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体共同转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清转染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达ICOS蛋白的L929细胞株;经RT-PCR、流式细胞仪表型检测证实L929基因转染细胞能稳定表达人ICOS蛋白。利用ICOS和CD40L基因转染细胞联合IL-10以及PWM驱动的B细胞体外培养系统,分析了ICOS在B细胞生长及抗体产生中的作用,实验结果表明,ICOS在PWM体外培养体系中,能有效地促进B细胞生长以及协同IL-10增加IgG的分泌。

高通量筛选孤儿受体和膜结合配体的MACS/FACS方法的建立(英文)

本文报道了一种用于分离、筛选孤儿受体和膜结合配体的高通量的表达克隆系统(expressioncloning system).该系统是以高效表达的逆转录病毒载体为核心,以高通量的磁力分离法(magneticcell sorter,MACS)和高精确度分选型流式细胞仪(FACS)相结合的独特的筛选方法.具体方法是将配体通过生物反应对固定在磁粒上(如biotin/streptavidin,Fc/protein A等).该磁粒的特点是非常微小,相当一个病毒颗粒.当配体蛋白结合到表达受体的BaF3细胞上时,该细胞将停留在MACS磁场中,从而与非受体表达细胞分开.MACS的优点是效率高,可同时操作上亿细胞.这些细胞是无法直接在分选型流式细胞仪上操作的.当这些阳性细胞增殖后,再次用同一配体染色,用更精确的分选型流式细胞仪分离,直至完全纯化.受体基因将用PCR方法,用载体引物克隆.利用该系统可以从1000000个细胞中筛选出低至2个表达配体/受体的阳性细胞.为验证该系统的可行性,应用该系统在相应的cDNA文库中筛选到2个已知基因的细胞受体.应用诱饵B7-1从人T淋巴细胞cDNA文库中筛选其功能受体CD28.应用B7-H2作为诱饵,从活化的人T淋巴细胞cDNA文库中筛选到ICOS.最终,从纯化的受体表达细胞中分离出受体的cDNA编码序列.这些结果表明,改进的表达克隆系统适合于大规模分离孤儿受体和膜结合配体,以及在后基因组时代用于研究新蛋白的功能.

ICOS信号与日本血吸虫感染小鼠Th9细胞极化的关系

目的检测可诱导共刺激分子(ICOS)在日本血吸虫感染小鼠脾脏Th9细胞中的表达水平,探讨ICOS信号与Th9细胞极化之间的关系。方法以日本血吸虫尾蚴感染小鼠,分别在感染后0、4、7、9周和12周,应用流式细胞术检测IL-9+细胞在CD4+T细胞中的比例,以及ICOS+细胞在Th9细胞中的比例。结果与0周比较,感染后4、7、9、12周,小鼠CD4+T细胞中Th9细胞的比例显著增高(P <0.05),并且Th9细胞ICOS的表达也明显上调(P <0.05)。结论在日本血吸虫感染中,ICOS信号对Th9细胞的极化可能具有调控作用。

蜈蚣败毒饮对银屑病模型鼠外周血中滤泡辅助性T细胞及其主导通路影响的机制研究

目的研究中药制剂蜈蚣败毒饮对银屑病模型鼠外周血中滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)的影响,并检测Tfh通路中关键刺激、转录、分泌因子的变化情况,结合银屑病模型鼠的皮损指数评估,分析皮损与Tfh细胞及其主导通路之间的相关性。方法将30只小鼠随机分为6组,分别为空白组、模型组、西药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。经咪喹莫特诱导建模,于药液灌胃前后采用鼠银屑病皮损面积和严重程度指数(mice psoriasis area and severity index,MPASI)评分法评价皮损指数,并计算其变化量(△MPASI);灌胃后采用流式细胞法检测外周血中标记CD4+CXCR5+的Tfh细胞数,采用ELISA法检测Tfh细胞主导通路中刺激因子(IL-6、IL-21)、转录因子(Bcl-6、STAT3)、分泌因子(CXCR5、ICOS、PD-1、CD40L)的血清含量;并采用线性回归分析法,整体评价各药物组小鼠△MPASI与Tfh通路各指标间的相关性。结果在皮损疗效方面,各药物组均能够改善银屑病模型鼠的皮损指数(P<0.05或P<0.01),以西药组和高剂量组的作用最为显著(P<0.01),中药各剂量组呈现出一定的量效依赖关系;在细胞表达方面,银屑病模型鼠外周血中Tfh的细胞数显著高于空白组小鼠(P<0.01),西药组和高剂量组小鼠Tfh细胞数显著减低(P<0.01),中药各剂量组对Tfh细胞均有显著的调控作用(P<0.01);在血清因子含量方面,Tfh主导通路在银屑病模型鼠中表现出异常表达的趋势(P<0.05或P<0.01),西药组和高剂量组能够显著下调IL-6、IL-21、Bcl-6、STAT3、CXCR5、ICOS、CD40L(P<0.01),上调PD-1(P<0.01);在相关性分析方面,△MPASI与Tfh细胞数及其通路中的关键因子均具有相关性(P<0.05),其中与PD-1呈正相关,与其余关键因子呈负相关。结论蜈蚣败毒饮可能通过调控Tfh细胞的表达及其主导通路中上下游因子的链锁式反应,发挥治疗银屑病的作用。

阻断诱导型共刺激分子信号通路对小鼠急性移植物抗宿主病的影响

目的：观察以诱导型共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）融合蛋白阻断ICOS-B7H途径对小鼠急性移植物抗宿主病（acute graft-versus—host disease，aGVHD）的作用。方法：建立以C57BL／6鼠为供体、致死剂量照射的BALB／c鼠为受体的aGVHD模型，分别在移植0、2、4、8d后腹腔注射100Ixg的ICOS-Ig，以注射同剂量的人Ig（h—Is）作为对照。观察小鼠体重、生存率及临床GVHD症状的改变；移植4d后取小鼠脾脏单个核细胞，流式细胞术检测H一2Kd—CD4＋及H-2Kd—CD8＋细胞的CFSE强度，确定供体T淋巴细胞的增殖率；移植10d后采用Annexin—V及PI试剂盒检测供体H-2Kd—CD4及H-2Kd—CD8＋细胞的凋亡率。结果：ICOS-Ig干预可有效减轻小鼠aGVHD的严重程度，ICOS—Ig组小鼠的生存时间比h-Ig组显著延长[（20．0±3．1）vs（10．0±2．1）d，P=0．0217，n=14]，其肠道黏膜病变及肝脏汇管区淋巴细胞浸润明显减少。移植3d后，ICOS-Ig组和h·Ig组小鼠的CD4＋CFSE-和CD8＋CFSE-细胞群比例无明显差异[（98．88±0．76）％铘（99．71±0．27）％，（98．62±0．63）％椰（99．53±0．51）％，P〉0．05]；ICOS—Ig增加了体内异基因CD8＋T淋巴细胞的凋亡率[（15．7±9．59）％掷（25．92±5．66）％，P=0．032]，不影响异基因CD4＋T细胞的凋亡率[（15．72±7．34）％vs（22．78±6．94）％，P=0．078]。结论：阻断ICOS—B7H通路可促进活化的T淋巴细胞凋亡，减轻造血干细胞移植治疗血液肿瘤中发生的aGVHD的严重程度。

全身放射治疗对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤微环境免疫细胞诱导协同刺激分子及其配体的影响

目的:探究全身放射治疗对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤微环境免疫细胞可诱导协同刺激分子(ICOS)及其配体(ICOSL)的影响。方法:选取45只BALB/c小鼠,采用数表法随机将其分为对照组、模型组和放疗组,每组15只。对照组不进行治疗;模型组和放疗组小鼠给予皮下注射宫颈癌细胞株建立荷瘤裸鼠模型,建模后第4 d行全身放射治疗。分别在建模后第4 d、6 d、8 d、10 d和12 d检测肿瘤体积,建模后第12 d检测免疫细胞水平。使用Westernblot和qRT-PCR检测ICOS、ICOSL蛋白和信使核糖核酸(mRNA)的水平。结果:模型组小鼠的肿瘤体积随着建模时间的延长显著升高,与对照组相比差异有统计学意义(F=129.625,P=0.000);在建模后第6 d、8 d、10 d和12 d,放疗组小鼠的肿瘤体积显著低于模型组,差异有统计学意义(F=56.405,P=0.000);模型组的基质金属蛋白酶2(MMP2蛋白)水平显著高于对照组(F=2.461,P=0.000)、基质金属蛋白酶9(MMP9蛋白)水平也显著高于对照组,差异有统计学意义(F=0.393,P=0.000);放疗组的MMP2和MMP9mRNA水平显著低于模型组,差异有统计学意义(F=1.590,F=0.601;P=0.000);放疗组小鼠的Th1细胞比例显著高于模型组,而Treg和Th2细胞比例显著低于模型组,差异有统计学意义(F=2.427,F=3.349,F=9.951;P=0.000);模型组小鼠的ICOS和ICOSL的水平显著高于对照组,差异有统计学意义(F=2.837,F=3.576;P=0.000);放疗组小鼠的ICOS和ICOSL的mRNA水平显著低于模型组,差异有统计学意义(F=0.793,F=3.750;P=0.000)。结论:全身放射治疗可有效的抑制宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤组织的生长,并可下调MMP2和MMP9表达水平,抑制ICOS及ICOSL表达水平,下调Treg细胞和Th2细胞的比例,从而解除免疫逃逸起到抑瘤作用。

四氯化碳诱导肝纤维化小鼠Tfh中ICOS的表达及ICOS阻断剂对IL-21表达的影响

目的探讨四氯化碳诱导肝纤维化小鼠滤泡辅助性T细胞(follicular helper cells,Tfh)中可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)的表达及ICOS阻断剂对白细胞介素(interleukin,IL)-21表达的影响。方法模型组(四氯化碳致肝纤维化组)与正常组BALB/c小鼠各40只,流式细胞仪分析测定不同阶段Tfh细胞的动态表达、Tfh细胞中ICOS的表达趋势及特征以及ICOS阻断剂处理后肝纤维化小鼠脾淋巴细胞中Tfh的IL-21的分泌水平。结果与正常组(0 W)CD4+T细胞中Tfh细胞群的比例相比,模型组CD4+CXCR5+Tfh细胞群的比例逐渐上调,13 W达到峰值,20 W虽有所下调但仍保持较高水平[0 W:(7.52±2.30)%,8 W:(20.45±4.16)%,13 W:(27.83±5.51)%,20 W:(22.97±4.71)%],差异有统计学意义(t值分别为8.56、9.62和8.34,P值均<0.05)。随着病程的进展,与正常组(0 W)相比,肝纤维化小鼠Tfh细胞群ICOS的表达水平逐渐上调,13 W达到峰值,20 W虽有所下调但仍保持较高水平[0 W:(6.45±2.04)%,8 W:(19.81±4.51)%,13 W:(41.20±7.17)%,20 W:(32.53±5.01)%],差异有统计学意义(t值分别为7.63、13.19、13.64,P值均<0.05)。在13 W,用流式细胞术检测Tfh细胞群IL-21的表达水平,结果显示,与ICOS阻断剂非处理组相比,ICOS阻断剂处理组Tfh细胞群IL-21的表达水平显著下调,差异有统计学意义[(8.89±3.92)%比(0.03±0.02)%,t=6.40,P<0.05]。结论肝纤维化小鼠Tfh细胞的数量和ICOS的表达显著上调,ICOS阻断剂可抑制Tfh细胞分泌IL-21,提示ICOS可能通过Tfh细胞调控肝纤维化的发生发展。