稳定高效表达木糖还原酶基因工业酿酒酵母的构建及木糖醇发酵的初步研究

将树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶基因XYL1连接到适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合载体pYMIKP中,构建得到表达质粒pYMIKP-XYL1,转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae6508。在G418平板上筛选转化子,得到含高拷贝木糖还原酶基因的酿酒酵母重组菌株XGH2,,该菌株的木糖还原酶比活力为0.8 U/mg(蛋白),比出发菌株提高了80倍以上,表明外源基因在工业菌株中实现了高效表达。摇瓶发酵结果显示,重组菌株XGH2木糖消耗为27.9 g/L,木糖消耗率为51%;木糖醇产量为30.2 g/L,木糖醇的转化率大于1.0 g/g木糖。

淀粉酶基因的克隆及其在工业啤酒酵母中的表达

以扣囊复膜孢酵母菌总DNA为模板, 通过PCR扩增克隆到约1.5kb的α-淀粉酶基因(AMY)。用酵母菌穿梭载体YEp352为出发质粒,磷酸甘油酸激酶基因1(PGK1)启动子和乙醇脱氢酶基因1(ADH1)终止子为调控元件构建了含α-淀粉酶基因编码序列的酵母菌重组表达质粒pLA8。pLA8导入工业啤酒酵母菌,在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子,转化子培养液中α-淀粉酶活性为1.1U/ml,细胞破碎液的酶活性为0.3U/ml,而受体菌培养液及细胞破碎液中未检测到α-淀粉酶活性。

三种微生物试验工业废水遗传毒性的比较

本研究应用Ames致突变试验、SOS/Umu测试法和酿酒酵母基因转变试验,对武汉市易家墩工业区三条排污渠水的遗传毒性进行检测,并对三种方法进行比较。初步结果表明,Ames试验与酿酒酵母基因转变试验对水样的测试结果基本一致,而SOS/Umu测试法的结果则与另两种试验结果不相符。此结果提示SOS/Umu测试法在对水中混合有机污染物遗传毒性的检测中尚不能代替Ames试验;而酿酒酵母检测系统可作为Ames试验的重要补充。

两株高糖分利用能力的酿酒酵母呼吸突变体选育

以酿酒酵母乙醇发酵高产工业菌株MF1002为始发菌株,对其营养细胞进紫外线诱变,筛选得到两株性状稳定的呼吸缺陷型突变体MF15c和MF11a。菌体细胞对2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)显色测定呼吸强度的结果表明,两突变菌株的相对呼吸强度分别只有始发菌株的57.77%和47.25%。与现有报道的呼吸缺陷突变体不同,两株突变体的细胞生长速率只在培养初期略低于始发菌株,总体生长速率与始发菌株几乎没有差异,在YPD平板上培养也不形成小菌落。比较蔗糖发酵试验表明,两株突变体的乙醇产量较始发菌株只分别略提高6.48%-6.59%(MF15c)和1.66%-1.97%(MF11a),但发酵终止的残总糖含量却显著低于始发菌株,分别减少34.85%和19.70%,发酵效率较始发菌株分别显著提高6.69%和4.71%,表明这两株突变体为新型的呼吸缺陷型突变。鉴于提高乙醇发酵的发酵效率可显著降低生产成本,认为这两株突变菌株具有较高的潜在工业利用价值。

利用26S rDNAD1/D2区序列和微卫星标记分析各种工业酿酒酵母的种内遗传差异

选取30株传统发酵工业中不同来源的酿酒酵母菌株和实验室常用酿酒酵母菌株,利用大亚基(26S)rDNA D1/D2区序列和微卫星标记分析酿酒酵母种内菌株间的遗传多样性和系统发育关系,以揭示酿酒酵母在长期的各种工业发酵环境下发生的遗传变异。结果表明:30株酿酒酵母的26S rDNA D1/D2区序列(591bp)比较保守,与测序菌株S288C相比序列相似度在99.8%–100%,说明种内菌株间存在一定的多态性,但序列差异并不十分明显,其变异情况表现在个别碱基的差异(大多由转换突变引起);通过扩增11个微卫星位点,每个菌株均有其独特的基因型,即30种基因型,共得到188个等位基因,观测杂合度平均值和期望杂合度平均值分别为0.576、0.886,多态信息含量平均值高达0.858,说明酿酒酵母种内菌株间具有较高的遗传多样性,而聚类分析表明30株酿酒酵母可以得到很好地区分,但是没有呈现与其工业来源相关的聚类。

野生型工业酿酒酵母Miseq测序方法的建立

新一代测序方法在基因组学研究应用日趋广泛,已经成为工业酿酒酵母菌株基因组学研究的重要技术平台,但对工业酿酒酵母新一代测序技术方法缺乏详细报道。Miseq是小型新一代基因组测序仪,本文报道我们自建的野生型工业酿酒酵母基因组Miseq测序方法。该方法包括：制备分离a型和α型交配型的单倍体菌株、采用电泳和分光光度法方法监控基因组文库建立、优化上机文库浓度后测序。其中电泳和分光光度法方法为首创的文库质量监控简易方法,质控检测得到酿酒酵母工业菌株测序条件为：菌株的基因组文库DNA片段大小为250-850bp且主要集中在350-550bp,文库浓度范围为7-13ng/μL;上机测序文库的优化浓度为20pM。