犬2型腺病毒的分离鉴定

研究旨在通过对采集自辽宁省辽阳某犬专业合作社犬传染性肝炎患犬病料进行分离和鉴定,了解犬腺病毒(CAV)的生物学特性。试验通过分子生物学鉴定、病毒分离、抗性测定、电镜观察、病毒特异性鉴定和动物回归试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,通过PCR扩增可得到1019 bp的特异性的核酸片段,命名为CAV A22株。通过核苷酸序列分析,分离株与GenBank上登录的国内外已发表CAV参考序列的核苷酸序列同源性最高达100%。由遗传进化树可知,分离株与U77082亲缘关系较近,处于同一分支;该分离株可在MDCK细胞上连续传代,病毒含量可达105.5TCID50/0.1 mL以上;电镜观察可见圆形、无囊膜、直径约80 nm的典型病毒粒子。病毒特异性鉴定表明分离株为犬2型腺病毒(CAV-2)。病毒回归试验表明,分离株致病力较弱,加以驯化可成为一株良好的疫苗毒株。

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白Loop1、Loop2基因的克隆与表达

腺病毒主要的中和抗原表位位于六邻体蛋白Loop1、Loop2上,目前的研究主要集中在人腺病毒,犬传染性肝炎病毒(即犬腺病毒Ⅰ型)尚未见报道。参考Genebank发表的基因序列设计引物,提取ICHV基因组DNA,,分别PCR扩增六邻体蛋白(Hexon)的Loop1、Loop2基因片段,用T4酶连接在一起,克隆入原核表达载体pET28a中,测序显示保存病毒分离株Loop1与CLL株、RI261株和Toronto A26/61株核苷酸序列同源性分别为100%、100%和83.8%;Loop2与CLL株、RI261株和Toronto A26/61株核苷酸序列同源性分别为88.1%、88.1%和99.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、93.6%和98.6%。转化BL21工程菌,实现了重组Loop蛋白在大肠杆菌中的高效表达,分子量约为36kDa,并且利用镍柱纯化重组蛋白,纯度达95%以上。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,以间接ELISA法测定血清抗病毒抗体效价达1320以上,western blot鉴定免疫血清与ICHV特异性结合。该实验为建立新的犬传染性肝炎病毒基因工程产品奠定了良好的基础。

用PCR技术鉴定犬传染性肝炎病毒强、弱毒株的研究

根据Genebank中发表的犬传染性肝炎病毒 (ICHV)标准强毒株Glaxo和人工驯化的弱毒疫苗株CLL的保守序列间大小不同 ,按照引物设计的原则 ,设计合成了一对通用引物。该对引物可由ICHV强毒株扩增出 569bp的片段 ,而弱毒株可扩增出 2 4 4bp的片段。对PCR产物分别进行电泳、酶切和测序 ,证明PCR产物片段大小、酶切位点和核苷酸序列与设计的产物完全一致。正常DK细胞上清和犬传染性喉气管炎病毒 (CAV 2 )强、弱毒株细胞培养物均不能被该引物扩增 ,说明具有良好的特异性。其检测到的病毒量分别为 1 5TCID50 、 31TCID50 、说明该技术具有很高的敏感性。可用于ICHV强。

犬传染性肝炎病毒的血凝抑制抗体和中和抗体的关系

犬传染性肝炎病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃａｎｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＩＣＨＶ）能诱导动物机体产生中和（Ｓｅｒｕｍ ｎｅｕｔｒｏｌｉｚａｔｉｏｎ，ＳＮ）抗体与血凝抑制（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＨＩ）抗体，本研究对８份ＩＣＨＶ免疫的犬血清同时进行了其ＳＮ抗体和ＨＩ抗体的检测，结果表明ＳＮ抗体和ＨＩ抗体具有正比线性关系ＳＮ≈８×ＨＩ，并绘制了标准曲线。由于血凝和ＨＩ试验不需应用活的试验宿主系统，而且可在３ ｈ内获得结果，操作经济简便，因此可通过测定ＨＩ抗体的效价来推算出ＳＮ抗体效价。

包涵体—犬传染性肝炎病毒形态发生学的重要特征

用免疫金电镜技术和电镜原位杂交技术观察了犬传染性肝炎病毒感染的犬肾传代细胞中的病毒包涵体,发现这些包涵体具有以下三种基本形态:1.松散均质包涵体;2.副结晶色包涵体;3.致密颗粒包涵体。其中前二种包涵体能被免疫金标记,它们是尚未成病毒粒子的病毒蛋白或是病毒装配后乘余的病毒蛋白,后一种包涵体能被病毒DNA探针标记,是病毒核酸合成过剩而堆积起来形成的产物。此外,本文还描述和讨论了包涵体与细胞及病毒发育成熟的关系。

离子捕获电镜技术在犬传染性肝炎病毒和细小病毒感染快速诊断中的应用

本研究应用离子捕获电镜技术和直接负染电镜技术比较检测了临床上疑似为犬传染性肝炎和犬细小病毒性肠炎的犬送检样品。结果表明 ,离子捕获电镜技术具有快速、简便、直观和敏感等优点 。

犬传染性肝炎病毒在体外细胞质内的发生

通过对犬传染性肝炎病毒（ＩＣＨＶ）在犬肾传代细胞内形态发生及其抗原定位的电镜和免疫胶体金电镜研究，发现ＩＣＨＶ除了在宿主细胞核内发生外，还有一条细胞质内的发生途径。在细胞质内病毒核壳体的装配是以均质致密包涵体和副晶格包涵体为“基地”，这与人们熟知的细胞核内形态发生方式相似。免疫胶体金标记显示，细胞质包涵体中含有大量的ＩＣＨＶ抗原成分，显核壳体在细胞质内装配病毒的结构蛋白来源。此外，在感染的细胞质内还观察到与核内相同的病毒核心样结构。

人工感染犬传染性肝炎病毒犬的肝组织的血凝特性

研究了人工感染犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus,ICHV)的犬的肝组织血凝特性,发现以往患传染性肝炎(ICH)的犬肝中HA抗原检测不出的原因,不是因为肝组织中的病毒量不足或病毒不完整,而是因为组织中含有不耐热的血凝抑制物和可与完整ICHV竞争红细胞膜上的HA受体的游离单价HA抗原之故。通过加热处理消除非特异性血凝抑制物和加入具有共同亚群抗原的犬Ⅱ型腺病毒的免疫血清,使此种游离单价HA抗原凝聚成具有HA活性的多价HA抗原的办法,能用于ICH微量HA诊断。

MDCK细胞感染犬传染性肝炎病毒后的超微结构观察

MDCK细胞感染犬传染性肝炎病毒(ICHV)BJ—1株后6h未见明显改变;12～18h胞核肿大,核内形成黑色颗粒样球状体;24h胞核内偶见病毒粒子,36h许多细胞内含病毒、病毒副晶体、形态各异的包涵体和多种板层样结构;48h感染细胞核膜以破损或出芽方式将成熟病毒粒子释入胞浆.

犬传染性肝炎病毒的细胞质内发生途径

应用免疫金电子显微镜技术,研究了犬传染性肝炎病毒(ICHV)在犬肾传代细胞内的形态发生及抗原定位,发现ICHV除了在宿主细胞核内发生外,还有细胞质内发生途径.在细胞质内,病毒核壳体的装配以均质致密包涵体和副晶格包涵体为“基地”,这与细胞核内形态发生方式相似.免疫金标记显示,细胞质包涵体中含有大量的ICHV抗原成分,是核壳体在细胞质内装配的病毒结构蛋白来源.同时,在感染的细胞质内也观察到与细胞核内相同的病毒核心样结构.

犬传染性肝炎病毒的形态发生学及抗原定位研究

应用免疫金电子显微镜技术研究了犬传染性肝炎病毒(ICHV)在犬肾传代细胞内的增殖过程及其病毒抗原在感染细胞内外的定位.结果显示:(1)吸附在细胞膜表面的病毒粒子,主要通过细胞吞饮作用侵入细胞,而吸附在微绒毛膜表面的病毒粒子则可直接“渗入”细胞;(2)在病毒感染不同时用的细胞核内观察到均质型、微粒型、颗粒型、副晶格型、病毒包涵体型及致密型等6种类型包涵体,其中前5种能被免疫金标记,它们是尚未形成病毒粒子的抗原蛋白、病毒装配后剩余的抗原蛋白或ICHV的病毒粒子结晶,致密型包涵体未被免疫金标记,可能是病毒DNA;(3)感染细胞内出现的某些特殊结构均不具有病毒抗原性,其中纤维样结构和管状结构在病毒增殖过程中起支持作用.