ISAV实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立ISAV(传染性鲑鱼贫血症病毒)实时荧光定量PCR检测方法,针对ISAV基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性的探针,建立实时荧光RT-PCR探针检测法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明:所建立的ISAV实时荧光RE-PCR探针检测法,引物和探针特异性良好,组内组间重复性良好,检出ISAV最小拷贝数为13拷贝。

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。

进口冰鲜大西洋鲑鱼中缺失型传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV-HPRΔ)的鉴定

为确保从挪威进口至四川的冰鲜大西洋鲑鱼的卫生与安全,防止有害生物因子传入我国。本试验参照OIE及相关国内行业标准推荐的水生动物疾病诊断手册中分子生物学检测方法,采用TaqMan荧光定量RT-PCR结合HE基因中高度多态区域(HPR)克隆测序等诊断方法,对从挪威进口至四川成都的某批次抽检去内脏冰鲜大西洋鲑鱼进行传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的检测。结果显示,该进口大西洋鲑鱼鱼肉中检出HPR缺失型ISAV,且其HPR区间存在51 bp的碱基缺失,基于HPR的序列分析结果提示其与分离自挪威的ISAV9和9/93 HPR缺失型ISAV的亲缘关系最近。结果表明,这是我国国内首例通过分子生物学方法,从进口大西洋鲑鱼鱼肉中检出HPR缺失型ISAV的案例,该结果警示各大水生动物检疫机构应重视对进口的去内脏冰鲜大西洋鲑鱼中ISAV的筛查,严防该病毒进入我国。