单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p>0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p>0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p>0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。

InlA／InlB基因的双缺失对单增李斯特菌毒力的影响

为了探讨InlA/InlB对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力的影响,本研究利用同源重组技术在LM△InlA菌株的基础上构建LMInlA/InlB基因双缺失株。通过小白鼠肝脾脑细菌计数、LD50和溶血实验,研究LM在InlA/InlB基因缺失后毒力上的差异。结果显示:LM△InlA/△InlB基因双缺失株与LM菌株相比,双缺失株的LD50升高2个数量级;与LM△InlA、LM△InlB菌株相比,双缺失株的LD50均升高1个数量级;双缺失菌株在小白鼠肝脏、脾脏和脑组织内的载菌量均显著减少(P<0.05);但没有改变其溶血特性。结果提示,InlA/InlB基因双缺失后,LM菌株的毒力能够明显减弱,但不改变其溶血特性。

单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株生长特性观察及对小鼠致病性研究

目的探究单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株的生物学特性。方法通过体外胁迫培养条件下OD600测定以及小鼠感染试验,对Lm90-△inlAB和Lm90的抗胁迫能力及细菌致病力进行研究。结果低温(4℃、30℃)环境下,Lm90和Lm90-△inlAB生长差异无统计学意义(t4℃=0.057,P>0.05;t30℃=0.441,P>0.05),适温37℃及42℃高温环境下,Lm90-△inlAB较Lm90生长受到抑制,生长差异具有统计学意义(t37℃=0.763,P<0.05;t42℃=1.147,P<0.05);体外耐酸碱试验中,Lm90-△inlAB耐酸性未明显改变,而耐碱能力强于亲本株Lm90,生长差异具有统计学意义(pH=9时t=2.837,P<0.05);在含有3.5%酒精的BHI培养基及含5%NaCl高渗BHI培养基中,Lm90-△inlAB增长趋势明显低于Lm90,生长差异具有统计学意义(t酒精=1.422,P<0.05;tNaCl=1.382,P<0.05),Lm90-△inlAB对酒精及高盐的耐受力显著低于Lm90;小鼠毒力测定结果表明,Lm90-△inlAB与Lm90半数致死量分别为106.94 CFU、105.68 CFU,Lm90-△inlAB毒力下降明显,在不同检测时间点Lm90-△inlAB在小鼠肝脏和脾脏内的载菌量均少于Lm90,载菌量差异具有统计学意义(t肝=2.454,P<0.05;t脾=2.443,P<0.05)。结论 Lm的抗胁迫能力可能随着基因的缺失发生显著改变,内化素InlA/InlB与单增李斯特菌侵染宿主的能力有一定的调控作用。缺失株生物学特性测定对研究Lm胁迫环境生存及毒力因子的致病机理提供了科学依据。

使用二重PCR方法快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。