基因捕获元件int1和ISCR1在临床菌株中的分布及与细菌耐药性的关系研究

目的研究临床多种细菌中的Ⅰ型整合酶编码基因int1和ISCR1的分布情况,探究其与细菌多药耐药表型的关系。方法收集2011-2012年河北省某医院临床菌株,应用VITEK2COMPACT全自动微生物生化鉴定系统和16SrDNA序列分析进行种属鉴定,利用PCR方法进行int1基因和ISCR1筛查;两种可移动元件的携带情况和菌株的多药耐药表型之间的关系采用卡方检验进行统计计算。结果共收集临床菌株372株,包括325株革兰氏阴性菌和47株革兰氏阳性菌;int1基因和ISCR1在22种(属)175株和18种(属)90株革兰氏阴性细菌中检出,同时在17种(属)71株革兰氏阴性细菌中检出,革兰氏阳性细菌int1基因和ISCR1检测均为阴性;通过对数据分层对比,统计分析发现,在int1基因不存在时,ISCR1的存在与否与菌株是否为多药耐药的关系明显,差异有统计学意义(P<0.01),其存在亦能介导更广泛种类药物耐受,差异亦有统计学意义(P<0.01)。在int1基因存在时,ISCR1的存在能介导更广泛种类药物耐受,差异有统计学意义(P=0.02);在ISCR1不存在时,int1基因的存在与否与菌株是否多药耐药的关系明显,差异有统计学意义(P<0.01),其存在亦能介导更广泛种类药物耐受,差异亦具有统计学意义(P<0.01)。而在ISCR1存在的情况下,上述两种关系不明显。结论基因捕获元件int1基因及ISCR1在革兰氏阴性临床菌株中分布广泛,并与细菌的多重耐药、泛耐药明显相关,特别是ISCR1;应加强可移动元件int1基因或ISCR1流行状况的监测,为其在耐药基因捕获中的作用机制研究和控制多药耐药细菌在临床散播提供可靠的基础数据。

MGB探针标记-实时荧光PCR方法检测细菌int1基因和ISCR1元件方法的建立

目的 建立一种快速、准确检测细菌中ISCR1复合型Ⅰ型整合子的MGB探针二重实时荧光PCR方法。方法 根据ISCR1复合型Ⅰ型整合子中int1基因和ISCR1元件序列设计特异性引物和探针,在多种经常携带有2种多耐药相关基因元件的细菌中检测其特异性;使用含有2种基因元件特异性序列的重组质粒标准品评价建立方法的灵敏度。结果 建立的MGB二重探针实时荧光PCR检测方法特异性好,携带2种基因元件或单独含有ISCR1或者int1的实验菌株均出现相应特异性扩增曲线,对2种基因元件均不含的菌株进行试验扩增时,均未见出现特异性扩增曲线。对2种基因元件都存在的实验菌株的扩增中,亦不存在由于2套引物/探针相互影响而造成的干扰扩增。根据标准质粒样品构建的标准曲线可确定其对int1基因和ISCR1元件的检测灵敏度分别为5.89×10~1拷贝/μl和4.13×10~1拷贝/μl。结论本研究成功建立了MGB二重探针实时荧光PCR快速检测方法。

畜禽粪便堆放地土壤中抗生素抗性基因和细菌群落的垂直分布特征

本文通过对养殖场猪粪和鸡粪堆放地0~100 cm土壤样品的采集和分析,研究了长期堆放畜禽粪便对土壤中抗生素抗性基因(简称"抗性基因")和细菌群落结构垂直分布的影响。定量PCR结果表明,与对照土壤相比,猪粪和鸡粪堆放增加了0~100 cm土壤中四环素类抗性基因(tetC、tetG、tetL、tetW)、磺胺类抗性基因(sulI、sulII)以及整合酶基因(intI1)的检出率和检出丰度,说明粪肥堆放造成堆放地土壤中抗性基因污染。聚类分析结果表明,抗性基因和intI1基因的丰度随土壤深度呈递减趋势,且主要集中在0~30 cm土层,表明堆放地土壤中抗性基因存在向下层土壤迁移的风险。相关性分析表明, intI1基因分别与抗性基因呈显著正相关,说明intI1基因可能在抗性基因传播中起着重要作用。同时高通量测序结果表明,与对照土壤相比,猪粪和鸡粪堆放显著降低了0~10 cm和10~30 cm土层细菌群落结构的多样性, 0~30 cm土层中,猪粪和鸡粪堆放地土壤中细菌群落结构与对照土壤的差异要高于深层土壤。此外,方差分解分析结果表明,土壤化学性质和细菌群落结构均影响了土壤中抗性基因的垂直分布,且细菌群落结构的变化是其主要的影响因素。本研究可为控制畜禽粪便堆放地土壤中抗性基因污染提供科学依据。