蓝细菌分离DnaE内含肽的自我剪接研究

【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时,两段分离的dnaE序列被克隆到同一表达载体,构建双重组表达质粒,两段序列具有各自的ORF,但由同一启动子调控。双重组表达质粒经诱导之后,利用以上获得的抗体对含有内含肽的DnaE蛋白在大肠杆菌表达体系中的自我剪接反应进行检测。【结果】在双重组表达质粒的表达产物中,抗体不仅可以分别与对应的蛋白质反应,而且还可以同时识别1条新条带,该条带的表观分子量与成熟DnaE的理论值大致相符。【结论】蓝细菌分离的DnaE内含肽在大肠杆菌表达体系中可以进行自我剪接;本研究中获得的抗体具有较好的特异性,无明显背景干扰,而且效价高,抗体可以稀释1 000倍以上使用,也可以用于相关方面的研究。

含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒设计、合成及高效表达载体的构建

目的:建立一种简便、快捷的基因从头设计、优化与合成策略,进行含有分裂型内含肽DnaE基因的表达盒全合成并构建高效表达载体。方法:以免费软件GeneDesign 3.0为主要平台,同时结合Tandem Repeats Finder、UNAFold等不同生物信息学软件,对含有DnaE基因、合适酶切位点的表达盒进行设计与分段合成;合成寡核苷酸片段通过重叠PCR进行组装与克隆。结果:利用建立的设计流程,合成了大小为44～64 nt的14段寡核苷酸片段,通过重叠PCR,实现了14段寡核苷酸片段的一次性组装,经过克隆、酶切鉴定、序列分析得到了序列完全正确的表达载体。结论:建立了一套有效的、基于免费软件的基因从头设计与合成的策略,构建了可以用于环肽小分子文库表达与筛选的表达载体。

Npu DnaE内含肽构建及其对293T细胞高效反式剪接活性分析

目的构建Npu DnaE内含肽,探讨Npu DnaE内含肽是否在293T细胞中具备高效反式剪接活性。方法制备融合基因Vn-NDn-myc和NDc-Vc,插入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体,构建质粒。转染293T细胞,荧光显微镜下观察目的蛋白Venus是否形成。48 h后收集细胞蛋白,应用Western blot技术进一步印证。结果构建的质粒经限制性内切酶鉴定及测序比对正确,转染293T后可见共转染细胞组出现明亮荧光,弥漫分布于细胞质中,Western blot证明高量目的蛋白Venus形成。结论成功构建Npu DnaE内含肽,其能在293T细胞中发挥反式剪接的生物学功能,并具有高效的剪接效率及功能目的蛋白形成率。

蓝细菌断裂DNA聚合酶DnaE的体内/外反式剪接分析

蓝细菌Anabaena PCC7120的DNA聚合酶DnaE由2个断裂基因dnaENI和dnaECI编码.通过纯化它们的部分基因在大肠杆菌中的表达产物DnaENI′和DnaECI′来免疫家兔获得抗体,用于对断裂的DnaE在体内和体外的反式剪接活性进行鉴定.在体外实验中,将2个断裂的DNA聚合酶DnaENI′和DnaECI′混合,进行反应,并利用它们的抗体对反应产物进行鉴定;在体内实验中,利用以上抗体对Anabaena PCC7120细胞总蛋白进行免疫杂交分析.实验结果表明,蓝细菌AnabaenaPCC7120中断裂的2个DnaE多肽在体内和体外均能进行反式剪接.体外实验中,纯化的DnaENI′和DnaECI′的混合反应产生新的蛋白产物,既有成熟的反式剪接产物DnaEN′-,又有剪切了内含肽后的副产物DnaEN′和DnaE,且DTT的存在对剪接反应具有促进作用;此外体内实验中,在Anabaena PCC7120细胞中既能检测到完整的DnaE,也能检测到未作用的DnaENI,但未能检测到DnaECI.

大肠杆菌BL21(DE3)中DnaE intein介导ABCA1蛋白的连接

【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的123个氨基酸的N端和36个氨基酸的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)。转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达后观察重组蛋白的表达和ABCA1的连接。【结果】转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示预期大小的ABCA1剪接蛋白条带,并进一步为His-Tag抗体进行的Western blotting证实。【结论】结果表明SspDnaEintein可有效催化ABCA1的连接,为进一步研究利用双腺相关病毒(AAV)载体转运ABCA1基因,克服单个AAV载体容量限制进行由ABCA1基因突变所致Tangier病的基因治疗奠定了基础。

断裂型内含肽Npu DnaE的C端序列赖氨酸突变对其剪接活性的影响

断裂型内含肽Nostoc punctiforme(Npu)DnaE作为一种为构建抗体-药物偶联物(ADC)过程中实现定点偶联的工具,其C端序列中的赖氨酸对其剪接活性有较大影响。该研究对断裂型内含肽Npu DnaE C端序列中的赖氨酸进行定点突变,得到了5种氨基酸(精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸)取代的多肽序列,以探究不同氨基酸取代对其剪接活性的影响。结果显示分别由精氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸3种氨基酸取代赖氨酸的内含肽C端序列保持了剪接活性,其中精氨酸取代的内含肽C端序列剪接效率较高。采用精氨酸取代的内含肽C端序列制备了ADC HER2-Lc-SMCCDM1,经检测其保有抗原亲和力和抗肿瘤活性。该研究结果为ADC的定点偶联和基于内含肽设计、改造蛋白质或多肽连接合成相关研究提供了技术支撑。

通过断裂内含肽介导的反式剪接合成大的蛋白

大肠杆菌难以表达大的蛋白,毒性蛋白以及膜蛋白,"Npu DnaE内含肽表达系统"使这些蛋白的表达成为可能。该系统的基本原理是:在特定位点处将目标基因(编码T7 RNA聚合酶的基因)断裂成两部分,然后分别与Npu DnaE内含肽的N端,C端片段融合,两种融合基因分别表达纯化,在体外将两种融合蛋白等摩尔比混合即可产生有功能的T7 RNA聚合酶。理论上,该体系也可用于合成其他大的蛋白,毒性蛋白或膜蛋白。