Experimental studies on the immune regulation of fibroblast cell mediated interleukin－6 gene therapy

Interleukin-6 (IL-6) is a pleiotropic cytokine which has antitumor activity. The present study describes a model of fibroblast cell mediated IL-6 gene therapy and discusses its immune regulatory effect. Human IL-6 cDNA was inserted into plasmid vector BCMGNeo containing a neomycin resistance gene. BCMGNeo-IL-6 was transfected into NIH3T3 fibroblast cells by the calcium phosphate coprecipitation method. A fibroblast cell clone (T6.6) secreting the highest level of IL-6 was selected by G418 resistance selection and limiting dilution. When this IL-6-secreting clone was implanted ip into the mice, IL-6 was detected in the serum 12h later, and remained at a high level 96h after implantation. Lymphocyte proliferation and IL-2 production was enhanced significantly after in vivo implantation of the clone T6.6. These results demonstrated that flbroblast cell mediated IL-6 gene therapy could augment immune function efficiently, which outlines a novel strategy for cancer treatment.

成纤维细胞介导的人白介素6基因疗法增强机体免疫功能的实验研究

通过研究成纤维细胞介导的人ＩＬ－６基因疗法对机体免疫功能的影响，结果发现，高分泌ＩＬ－６成纤维细胞克隆体内移植后，能显著提高淋巴细胞增殖反应、ＩＬ－２和ＩＦＮ－ｒ产生水平以及ＮＫ和ＬＡＫ细胞的杀伤活性，当与ＩＬ－２合用时，对ＮＫ和ＬＡＫ活性的增强作用更加明显，表明成纤维细胞能显著增强机体免疫功能，可望为肿瘤生物治疗、造血功能重建等开辟新的途径。

成纤维细胞介导的人白细胞介素6基因疗法的建立及其体内白细胞介素6分泌水平的实验研究

细胞因子基因治疗是近年来生物治疗的重要进展。本文以人IL-6基因为治疗目的基因,以成纤维细胞为载体细胞,建立了人IL-6基因疗法的实验模型,并动态观察了其体内IL-6分泌水平.将650bp的人IL-6 cDNA 插入到携有Neo^R 基因的表达载体BCMGNeo 的Xho I 位点上,对此重组表达载体进行限制性酶切鉴定。用磷酸钙共沉淀法将BCMGNeo-IL-6转入NIH3T3成纤维细胞中,通过G418抗性筛选、有限稀释和上清中IL-6活性的测定,从多株阳性克隆中筛选到一株高分泌IL-6(184.6U/ml)的克隆株。对此阳性克隆进行了Southern 杂交分析。将此阳性克隆体外扩增、包裹入胶原中,然后移植入小鼠腹腔内,可从小鼠血清中(直至移植后15天)检测出IL-6,明成纤维细胞能成功地将IL-6基因导入体内并有效表达,证明该基因疗法是可行的。

成纤维细胞介导白细胞介素6基因疗法对化疗导致的造血损伤的恢复作用

研究了成纤维细胞介导的人白细胞介素６（Ｉｎｔｅｔｒｌｅｕｋｉｎ－６，ＩＬ－６）基因疗法对预先体内注射１５０ｍｇ／ｋｇ５－氟尿嘧啶（５－ＦＵ）所造成的造血损伤小鼠模型的治疗作用。结果发现，外周血血小板数量在移殖高分泌ＩＬ－６成纤维细胞后第１０天开始持续上升，第２２天血小板数量恢复到化疗前水平，中性粒细胞数量也显著增高，但对白细胞恢复没有明显的促进作用。骨髓和脾脏ＣＦＵ－ＧＭ及ＣＦＵ－ＭＫ在体内移殖高分泌ＩＬ－６成纤维细胞后，体外动态观察发现：骨髓和脾脏ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ在第４～７天左右数量为０，在第１０天左右数量开始上升，于第１６天左右数量显著增高，对ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ具有明显的恢复作用，ＣＦＵ－Ｓ数量也显著增高。表明成纤维细胞介导的白细胞介素６基因疗法能显著治疗化疗导致的造血损伤，可望为肿瘤放、化疗导致的机体造血损伤提供新的治疗途径。

白细胞介素3基因疗法和白细胞介素6基因疗法的联合造血调控作用

研究了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法、ＩＬ－６基因疗法以及两者联合后对造血系统的影响。结果发现，单用ＩＬ－３基因疗法的小鼠白细胞总数、中性粒细胞、骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ等显著上升，但血小板上升程度软弱；单用ＩＬ－６基因疗法的小鼠血小板、中性粒细胞、骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ等显著上升，但白细胞总数上升不明显；当两者联合后可使血小板、中性粒细胞、骨髓ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＭＫ上升更为显著；且达高峰时间提前。表明联合应用成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法和ＩＬ－６基因疗法能比单一疗法更显著增强机体骨髓造血功能，使外周血细胞升高，从而为肿瘤患者放化疗后机体造血功能低下的治疗开辟了新的途径。

成纤维细胞介导的白细胞介素6基因疗法的建立及其免疫调节作用

以成纤维细胞为载体,建立了IL-6基因疗法的实验模型并研究了其免疫调节作用。将人IL-6cDNA插入到携有新霉素抗性基因的表达质粒BCMGNeo上,用磷酸钙共沉淀法将BCMGNeo-IL-6转染入成纤维细胞NIH3T3中,用G_(418)抗性筛选和有限稀释法,挑选到一株高分泌IL-6的成纤维细胞克隆(T6.6)。将T6.6移植到小鼠腹腔内,12h后即可从血清中枪测出IL-6,至96h,血清中IL-6仍维持在较高水甲。T6.6体内移植后能显著增强淋巴细胞增殖反应和IL-2产生水平。表明成纤维细胞介导的IL-6基因疗法能有效地增强免疫功能,可望为肿瘤治疗开辟一条新途径。

人白细胞介素6基因转移的成纤维细胞对自然杀伤活性的增强作用

应用磷酸钙共沉淀法将人白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转入成纤维细胞ＨＩＨ３Ｔ３，经Ｇ４１８抗性筛选和有限稀释法，从１２株阳性细胞克隆中选出一株高分泌ＩＬ－６克隆（代号为Ｔ６．６）。Ｔ６．６培养上清能显著增强自然杀伤（ＮＫ）活性，当与ＩＬ－２合用时增强效果更佳，抗ＩＬ－６单抗能阻断这种增强作用。将Ｔ６．６大量扩增后植入小鼠腹腔，４８小时后血清中可检测出较高水平的ＩＬ－６，且脾细胞ＮＫ活性比对照组显著升高。实验结果表明，人ＩＬ－６基因转移的成纤维细胞在体内、外均能显著增强ＮＫ活性，提示成纤维细胞介导的ＩＬ－６基因疗法可应用于抗肿瘤、抗感染和造血功能重建等。