ITS2条形码对白及属植物的初步分析研究

本研究通过ITS2条形码对云南白及本地种的分布情况初步了解,并对药用白及和云南本地种进行分析研究。选取滇东南、滇东北、滇西北、滇西的材料,进行DNA提取、PCR、测序,MEGA 5.1软件进行序列比对、NJ系统聚类树构建,并预测ITS2二级结构。结果表明:药用白及和本地种ITS2序列之间存在明显差异,在NJ树上分别聚为两类。ITS2可以区分药用白及和本地种,且可以作为初步分析药用白及真伪的潜在条形码。

rDNA-ITS2应用于赤眼蜂分子鉴定的研究

本研究通过对拟澳洲赤眼蜂 Trichogramma confusum、甘蓝夜蛾赤眼蜂 T. brassicae、广赤眼蜂 T.evanescens、食胚赤眼蜂 T. embryophagum,及松毛虫赤眼蜂 T. dendrolimi的 6个地理种群的 r DNA- ITS2进行克隆测序 ,又运用软件 DNAStar的 Meg Align程序对不同赤眼蜂属间、赤眼蜂属种间、同种不同地理种群之间以及同一赤眼蜂个体不同拷贝之间的 ITS2序列的遗传分歧及相似性进行了分析。结果表明 :赤眼蜂属与外群 ITS2序列的遗传相似性很低、赤眼蜂属内不同种之间 ITS2序列保守性适中、种内或不同地理种群之间以及同一个体不同 ITS2拷贝间非常保守。说明

栀子栽培品种与近缘种的ITS2序列分析

【目的】栀子属植物是重要的观赏、药用、色素和油用资源植物,有着悠久的栽培历史。由于生长环境的不同,以及长期的人工栽培和选育,使其习性、叶的形状、花的形态、果实的形状及大小等发生诸多变异,使得栀子栽培群体的变异类型丰富,并形成了一些较为稳定的品种类型。开展栀子栽培品种和近缘种核糖体DNA内部转录间隔区2(nrDNA ITS2)序列变异程度、遗传距离和亲缘关系研究,为栀子属植物品种鉴定、遗传育种及多样性保护提供科学依据。【方法】以保存于江西省林业科学院中药资源圃内的栀子18个栽培品种和3个近缘种共38个样品为试验材料,进行聚合酶链式反应(PCR)直接测序法,对样品进行ITS2片段扩增和双向测序,所得序列用Codon Code Aligner v6.0.1软件拼接后,采用Lasergene Edit Seq 11.1软件进行平均碱基组成百分比统计,用MEGA7.0软件进行分析比对,获得序列长度、GC含量以及变异位点,基于K2P模型分析遗传距离,用UPGMA法构建系统聚类树。【结果】序列变异程度分析显示,狭叶栀子和栀子的ITS2序列长度均为347 bp,GC含量为66.86%,大黄栀子序列长度为355 bp,GC含量为67.61%,栀子栽培品种序列长度除‘燃叶’、‘金福水栀’为348 bp外,其他品种序列长度和栀子一致,均为347 bp,栀子栽培品种与近缘种间的平均GC含量相差不明显,GC含量为66.28%~67.15%,其中‘白蟾’GC含量最低,‘雀舌栀子’和‘银边雀舌’GC含量最高。所有样本ITS2序列比对共产生12个变异位点,10个碱基插入,其中8个碱基插入是大黄栀子所独有的,且存在5个特异的变异位点,一部分表型特征有共性的品种之间有共同的变异位点,如植株矮小、叶片小而窄长的品种‘雀舌栀子’和‘银边雀舌’在50 bp处,果实相对较大的品种‘分关1号’、‘金福水栀’和‘金元’在84 bp处等。一些品种具有特异的变异位点,如‘白蟾’(133 bp处)、‘小白蟾’(229 bp处)等。序列遗传距离分析显示,栀子属种间遗传距离普遍小于近缘种和品种间的遗传距离,大于栀子栽培品种之间的遗传距离,所有样本平均遗传距离为0.0055,大黄栀子和‘白蟾’间遗传距离最大,为0.0206。聚类分析结果显示,栀子属乔木树种大黄栀子单独成一支,与栀子属其它种和栀子栽培品种亲缘关系最远,狭叶栀子和野生栀子所有个体总体表现出较近的亲缘关系。【结论】分析结果表明,3种栀子属植物在ITS2序列长度和GC含量上表现出较高的保守性,研究发现的部分品种共同变异位点以及部分品种特异变异位点将对栀子品种鉴定有较大的应用价值。部分聚类结果和以表型数据为基础的数量分类结果类似,但并没有像数量分类结果那样以花重瓣、大果、小果等性状形成明显的系统分枝,研究结果对栀子品种起源、资源保护和种质创新等方面有重要的指导价值。

白前及其混伪品的ITS2分子鉴定

目的:采用ITS2序列鉴定白前及其易混伪品,为准确鉴别白前和保证临床用药的安全性提供参考。方法:白前与其混伪品的ITS2序列从Gen Bank数据库中获取,然后使用MEGA 6.06软件进行种内、种间序列变异分析、构建邻接系统树(NJ树)并计算遗传距离,运用ITS2数据库相似性搜索引擎预测ITS2二级结构。结果:白前ITS2序列长度在246~270 bp范围内,种内变异少且种间存在明显差异,与所有混伪品种间遗传距离为0.026~0.309。NJ树显示白前独聚一支,另外白前有明显ITS2二级结构特征,可与其混伪品明显区分。结论:ITS2序列能够有效地区分白前与其混伪品,为白前的用药安全提供技术保障。

眼蚤属(Ophthalmopsylla)两蚤种的rDNA ITS2序列研究

目的:研究伏河眼蚤异常亚种Ophthalmopsylla volgensis extrema(Ioffet Scalon,1953)和长突眼蚤Oph-thalmopsylla kiritschenkoi(Wagner,1930)rDNA ITS2序列,为蚤类分子系统发育的研究提供基础资料。方法:PCR扩增两蚤种rDNA ITS2片段并测序,比较两者差异。结果:伏河眼蚤异常亚种rDNA ITS2序列长372 bp,长突眼蚤长380 bp;两蚤种间共有30处碱基不同,包括16处缺失/插入、4处转换、10处颠换,种内无差异。结论:rDNA ITS2序列可用作两蚤种鉴别的分子标记。

基于DNA条形码(ITS2)的中药材防风与其混伪品的鉴定

目的通过ITS2序列分析,对防风及其易混伪品进行鉴定,确保用药安全。方法从Gen Bank数据库下载中药材防风与其混伪品的DNA条形码ITS2序列,利用MEGA 6.06软件进行比对分析,计算GC含量及变异位点、种内、种间遗传距离,并构建NJ系统发育树,应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果序列分析与遗传距离结果显示,防风与其混伪品存在明显差异,基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将防风与其混伪品进行区分。结论 ITS2能够准确鉴定防风及其易混伪品,可用于中药材的快速鉴别。

白色念珠菌ITS2的实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及评价

目的建立一种快速鉴定白色念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法在白色念珠菌核糖体RNA编码基因(r DNA)中的内转录间隔区2(ITS2)上设计特异性引物和Taq Man-MGB探针,通过实时荧光定量PCR分析系统建立白色念珠菌的检测方法,对其敏感度、重复性和特异性进行方法学评价,并在模拟白色念珠菌血症的血标本中初步探讨其应用价值。结果所建方法对白色念珠菌纯菌液的准确检测下限为101CFU/ml,相应的批内、批间变异系数(CV)分别为1.57%和2.20%。对135株白色念珠菌临床分离株、其他非白念菌株、细菌临床分离株和血液标本进行检测,结果显示该方法特异性为100%。另外,对于模拟白色念珠菌血症的血标本,该方法的最低检测下限为102CFU/ml。结论所建方法具有特异性和敏感度高、重复性好的特性,可适用于临床上白色念珠菌引起的血流感染的快速鉴定。

利用ITS2序列识别盾蚧科昆虫

[目的]盾蚧科隶属于半翅目蚧总科,大多数种类是危害很严重的经济害虫。由于其外部形态特征简单,导致识别该类群物种相对困难。利用DNA条形码为解决这个问题提供有效的方法。[方法]共采集了5个省47个样本,属于7属11个种,并从GeneBank下载了4属5个物种的序列。采用distance-based方法和tree-based方法对ITS2基因片段是否可以作为盾蚧科DNA条形码的补充做了分析。[结果]虽然ITS2没有Barcode gap存在,然而所有的分支都表现出了明显的单系群,表现出较高的物种识别能力。同时,Best Match(BM)和Best closed match(BCM)也表现出了超过90%的识别能力。[结论]这些结果证实ITS2在盾蚧科物种的识别有效性方面具有较高的应用价值。

ITS2序列作为青风藤DNA条形码的研究

采用DNA试剂盒法提取采自不同地区的青风藤及其类似植物的基因组DNA,设计通用ITS2引物进行PCR扩增和测序,运用生物信息学软件对序列进行分析,从而对青风藤及其类似植物进行分子鉴定。结果表明：产地为陕西、贵州、湖北的青风藤样品序列长度分别为380~437、429~436、434~438 bp,GC含量在54.2%~55.7%,平均GC含量约为55%。青风藤及其类似植物的ITS2序列存在较大差异,且平均K2P遗传距离明显大于青风藤的种内平均K2P遗传距离。这说明内转录间隔区2（ITS2）作为DNA条形码可准确地鉴别青风藤与其他类似植物,为中药材的鉴别提供了新途径。

Sequence differences of rDNA-ITS2 and species-diagnostic PCR assay of Anopheles sinensis and Anopheles anthropophagus from China

Anopheles sinensis and An. anihropophagus are two morphologically indistinguishable yet genetically and behaviorally distinct mosquito species that vary dramatically in their importance as vectors of malaria inChina. The sequence of the ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) was determined for bothspecies to assess the species differentiation. The lengths of ITS2 was 468 hp for An. sinensis and 452 hp forAn. anthropophagus. Interspecies difference in sequence was 28. 8%. Intraspecies sequence divergence wasnegligible. A PCR method was developed for distinguishing the two species based on the species-specific variations of the ITS2 sequences. The method would amplify a diagnostic fragment in length of 425 hp for An.sinensis and 253 hp for An. anthropophagus. Field collections from 12 localities in 10 provinces of China weretested. In 440 mosquitoes identified by adult morphological characteristics as An. sinensis, 291 (66. 2 % ) wereidentified later as An. sinensis and 56 (12. 7 % ) as An. anthropophagus, the remaining 93 (22. 1 % ) were notamplified by PCR. The results showed that the morphological characteritics of adult was not reliable for fieldidentification. The PCR assay was a simple, fast and reliable method for species identification.

基于DNA条形码和PCR-RFLP技术的进口紫草ITS2序列特征研究

目的:基于DNA条形码和PCR-RFLP技术研究进口紫草ITS2序列的特征,为市场紫草药材和饮片的质量控制与真伪鉴别提供参考依据。方法:选用ITS2区域作为对进口紫草和紫草对照药材进行比较、鉴定的DNA条形码序列,并基于DNA条形码和PCR-RFLP技术比较不同来源进口紫草的ITS2序列与紫草对照药材的异同。结果:39份进口紫草样品经限制性内切酶AluI酶切后,其产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,仅DH3在500 bp左右有条带,而在100~300 bp无条带,其余样品均在100~300 bp有2条或3条明显条带;进口紫草样品与紫草对照药材的ITS2序列进行比对,其中样品DH3与紫草对照药材的碱基差异最多,有15个碱基差异,样品F2与紫草对照药材的ITS2序列一致,其他进口紫草样品与紫草对照药材的碱基差异为1~9个碱基;从聚类结果中可以看出进口紫草样品DH3与其他进口紫草样品和紫草对照药材均明显区分,独自为一枝,而与紫草对照药材共同聚为一枝且支持率≥50%的样品共有14个。结论:选用ITS2区域,基于DNA条形码和PCR-RFLP技术,比较了进口紫草与紫草对照药材ITS2序列的异同,为紫草药材及饮片的有效鉴定提供参考依据,为紫草药材的市场监管提供有力保障。

11株螨虫分离株的ITS－2序列分析与系统关系研究

为探讨动物体上一些常见寄生螨虫的分类地位，对11株螨虫分离株的核糖体第二内部转录间隔区（ITS-2）基因序列进行测定，并从GenBank下载21条螨虫的ITS-2序列，用UPGMA法构建分子系统树。序列分析结果显示：6株疥螨分离株ITS－2基因全长均为361bp，含有335个保守性位点，15个变异位点和9个简约信息位点；序列间的同源性为96．9％～99．7％。5株足螨分离株ITS－2基因存在长度上的变异（225～232bp），序列中包括184个保守性位点，44个变异位点，9个简约信息位点；分离自黄牛和奶牛的4株足螨分离株的ITS-2序列同源性为92．4％～97．3％，而熊猫足螨分离株同黄牛、奶牛足螨分离株的同源性较低（78．7％～82．6％）。UPGMA显示：32株螨虫分离株分成2个支系，第1个支系包括疥螨科的疥螨属Sarcoptes和背肛螨属Notoedres；第2个支系包括痒螨科的足螨属Chorioptes和痒螨属Psoroptes。从分析结果来看，笔者支持疥螨的单种说法；而足螨属中分离自熊猫的足螨和痒螨属中分离自水牛的痒螨的分类地位还有待进一步探讨。

嗜群血蜱和长角血蜱ITS-2、COⅠ和COⅡ基因序列变异与亲缘关系分析

本研究旨在阐明长角血蜱与嗜群血蜱间的亲缘关系。采用聚合酶链式反应(PCR)技术从长角血蜱和嗜群血蜱基因组DNA中扩增得到核糖体第二内部转录间隔区基因(ITS-2)片段、线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)片段和线粒体细胞色素氧化酶亚基II基因(COⅡ)片段,并进行测序,进而分析其基因变异与系统发育。结果表明,长角血蜱和嗜群血蜱的ITS-2、COⅠ和COⅡ基因片段的大小存在差异,长角血蜱3种基因分别为361、479和647bp,嗜群血蜱基因分别为354、474和661bp。长角血蜱与嗜群血蜱间ITS-2、COⅠ和COⅡ基因的相似性分别为84.2%、89.0%和88.4%。以3种基因构建的NJ进化树中,长角血蜱和嗜群血蜱均聚类。因此,认为长角血蜱和嗜群血蜱间ITS-2、COI和COII基因间变异较小,它们是血蜱属中亲缘关系较近的2个有效种,支持传统形态学的分类地位。

基于SCAR标记和DNA条形码技术的苍术基原鉴别研究

目的开发出能同时鉴别北苍术和关苍术的分子标记方法,并探究不同种质资源苍术的遗传进化关系。方法对不同地区北苍术Atractylodes chinensis(Bunge)Koidz及关苍术A.japonica Koidz.ex Kitam基因组DNA的差异片段进行测序,结合SRAP、ISSR、DAMD分子标记方法,优化PCR反应体系,筛选并转换成特异性标记,同时,采用条形码方法分析种间序列差异。结果通过SRAP、ISSR、DAMD三种分子标记方法的PCR扩增,共筛选出198对能稳定扩增且重现性好的引物,转换出7对能稳定、快速鉴别北苍术和关苍术的SCAR引物。条形码方法检测出北苍术ITS2序列长度为454 bp,关苍术ITS2序列长度为453 bp,与其他苍术属植物之间遗传距离较远。NJ树结果显示,北苍术、关苍术及其他苍术属植物均各自聚为一支,表现出良好的单系性。依据ITS2二级结构,4种苍术属植物在螺旋区的茎环数目、大小、位置均有明显差异,可以直观地进行区分。结论所开发的特异性SCAR标记为苍术属植物优良品种的筛选提供了新方法,DNA条形码能稳定、准确鉴别北苍术。

长耳珠母贝核rRNA基因ITS-2序列分析

以相应引物聚合酶链式反应(PCR)扩增长耳珠母贝(Pinctadachemnitzi)核核糖体RNA基因第2转录间隔区(ITS 2),PCR产物大小约500bp,经克隆、测序,所得序列包含5.8S和28SrRNA基因部分序列和ITS 2全序列,4种碱基含量分别为27.11%(A)、24.95%(G)、21.26%(T)和26.68%(C)。5个克隆的DNA序列差异为0.0%—0.4%,不存在个体内变异。对其潜在应用进行了讨论。

我国4种白蛉的核糖体内转录间隔2区PCR-RFLP多态性分析

采用PCR-RFLP方法对我国内脏利什曼病传播媒介中华白蛉(Phlebotomus chinensis)、吴氏白蛉(Ph.wui)、长管白蛉(Ph.longiductus)和亚历山大白蛉(Ph.alexandri)等4种白蛉的核糖体内转录间隔2区(ITS2)进行分型。PCR-RFLP结果显示,以限制性内切酶DraⅠ酶切ITS2片段,可分出4种RFLP带型,即A为450 bp,B为154 bp/127 bp/93 bp/66 bp/10 bp,C为311 bp/80 bp/60 bp,D为353 bp/300 bp/160 bp/58 bp。结果显示,4种白蛉均只有1种RFLP带型,中华白蛉为AA型,亚历山大白蛉为BB型,吴氏白蛉为CC型,长管白蛉为DD型。利用PCR-RFLP方法可区分我国4种内脏利什曼病传播媒介的种类。

核糖体转录间隔子2应用于鱼类种属的鉴别

为了防止珍稀鱼类的非法捕捞和销售,鱼类种属的鉴别就成为非常关键的问题,特别是形态学方法无法区分的样品(如鱼苗、鱼鳞、鱼卵、鱼肉及其加工产品等)。为了帮助珍稀鱼类资源的管理和保护,文章报道了一种利用核糖体基因的转录间隔子2鉴别鱼类种属的分子遗传学方法:(1)利用同一目鱼类5.8SrRNA和28SrRNA基因的保守性,设计出扩增鲤形目鱼类这两个基因间转录间隔子2DNA片段,测序获得它们的碱基排列顺序;(2)再根据不同鱼类转录间隔子2序列的差异,设计出每种鱼的种属特异引物、种属鉴别标准物,构建鱼类分子分类图谱,利用PCR复合扩增技术鉴别鱼类种属。通过对国内不同地方采集的5种鲤形目鱼类的210个单一品种样本和40个混合样本的鉴别检验,该方法能够准确、灵敏和快速鉴别这5种鱼,可用于鱼类资源保护和评估、管理和开发,特别是在渔业管理人员渔业执法、海关打击珍稀鱼类走私、防止商业欺诈和外来有害生物入侵等方面非常有用。

放养型和野生型柞蚕的核糖体基因转录间隔区Ⅱ(ITS-2)的克隆与序列比较

核糖体基因转录间隔区Ⅱ(ITS-2)在物种间甚至种内群体间均表现出较高的差异,被用于种内或近缘种的研究。测定了放养型和野生型柞蚕(Antheraea pernyi)的rDNA ITS-2全长序列(GenBank登录号:GU073314、GU073315),并分析了二者之间的遗传差异。放养型和野生型柞蚕的rDNA ITS-2全长分别为1 111、1 112 bp,2个序列的GC含量达到61%,相似性高达98%。序列比对后得到1 117 bp的对齐序列,共鉴定变异位点19个,其中转换位点8个,无颠换,有11处发生核苷酸的插入/缺失。基于K2P模型计算的2条rDNA ITS-2序列的遗传距离为0.007,这一数值与估算的鳞翅目昆虫rDNA ITS-2序列种内平均遗传距离(0.009)基本一致。

PCR为基础的反向线点杂交及16S～23S rDNA间区测序分析5种少见类型奴卡菌

目的探讨5种新出现的奴卡菌种16S～23S rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)DNA基因序列的多态性,筛查特异的奴卡菌种逆向线点杂交(reverse line blot,RLB)探针。方法对6例奴卡菌标本进行ITS基因扩增、克隆、测序,设计奴卡菌种特异探针及ITS间区rDNA基因特异的探针,进行以PCR为基础的RLB(PCR/RLB)杂交试验,不同的RLB型进行ITS基因测序分析,以鉴别不同的奴卡菌种及种内分型。结果发现2个Nocardia beijingensis菌株ITS间区有8个基因序列型,4个RLB型;N.thailandica有4个基因序列型及RLB型;N.blacklockiae有5个基因序列型,3个RLB型,其中N-bla RLBⅢ型与所有Nbla-ITS探针杂交没有信号;N.elegans有5个基因序列型,3个RLB型;N.vinacea有5个基因序列型,2个RLB型。结论通过PCR/RLB试验,准确的ITS基因测序认识了新出现的菌种,即N.beijingensis,N.blacklockiae,N.elegans,N.thailandica及N.vinacea。同时建立了可以大量筛查奴卡菌种的PCR/RLB方法,以进行快速临床诊断及流行病学研究。

内部核糖体进入位点(IRES)调控多种癌细胞系中尾型同源盒转录因子2的翻译

尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)促进肠癌细胞增殖,并具有致瘤的潜能。然而,对于CDX2翻译水平的调控机制研究甚少。本研究基于转染及报告酶活性分析结果,首次证明CDX2 5'非翻译区(5'untranslated region,5'-UTR)存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),并通过IRES在HEK293细胞以及肝癌、肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞株中介导翻译起始。IRES介导的翻译机制与经典的帽依赖翻译途径(cap-dependent translation)不同,在一些IRES反式作用因子(IRES trans-acting factors,ITAFs)的作用下,不需要帽状结构,IRES可以直接招募核糖体小亚基,起始翻译。同时,肿瘤细胞内IRES介导的翻译方式可能是引起蛋白质异常表达的原因之一。通过Western印迹检测CDX2在4种肿瘤细胞系中的表达,发现CDX2的IRES活性与其在肿瘤细胞中蛋白质表达量正相关,其活性在耐药型卵巢肿瘤细胞株中最高。此外,CDX2 IRES元件的5'端截短及报告酶活性分析证明,CDX2 5'-UTR的活性中心位于68~147碱基之间,而位于5'末端的67个碱基形成一个远端茎环,抑制全长IRES的活性。定点突变68~147活性区域的实验结果揭示,3个茎环结构域(68GCCGGC73,88GCCAG92和114CUCUG118)是IRES元件中不可或缺的部分。上述结果证明,CDX2 5'-UTR具有IRES活性,其活性依赖于二级茎环结构。因此,可以针对特殊的茎环结构域进行研究,使之成为肿瘤药物作用靶点。