内蒙古不同产地小秦艽ITS序列比较研究

目的:研究内蒙古不同产地野生小秦艽内转录间隔区(ITS)序列的遗传变异情况并进行聚类分析,为保护及优化小秦艽种质资源提供参考。方法:对野外采集的内蒙古不同产地的62份小秦艽样品进行DNA提取,选取合适引物进行PCR扩增并测序,测序结果使用BioEdit、CLC Sequence Viewer 8及MEGA 11.0软件进行处理后,分析遗传变异并构建系统发育树。结果:聚类分析结果表明,62份小秦艽样品主要分为两支,编号为BT1(采自包头市白云鄂博巴润园区东南1 km处)和BY1(采自巴彦淖尔盟乌拉特前旗阿嘎如泰苏木大桦背)的样品聚为一个小分支,其他60份样品聚为一个大分支,说明各分支内存在较近的亲缘关系,遗传变异过程相似;在相似的遗传变异条件下,样品中龙胆苦苷含量相近,排除环境主要生态因子的影响,推测小秦艽样品的龙胆苦苷含量可能与遗传变异过程相关;样品BT1和HH4(呼和浩特市和林格尔县太平夭),BT1和AL1(阿拉善左旗巴润别立镇贺兰山雪岭子沟)的遗传距离最大,因其地理距离较大,推测地理环境因素在一定程度上影响了小秦艽的生物进化过程;序列中的变异位点为129个;各样品ITS序列的Kimura-2-parameter(K2P)遗传距离范围为0.0000~0.2632,平均值为0.0494。结论:DNA分子技术—ITS序列有助于研究药用植物小秦艽种质资源遗传多样性,了解种内遗传变异的大小及其与环境的关系,从而保护及发展小秦艽种源优势。

新颖栽培丹参材料的rDNA内外转录间隔区(ITS和ETS)分子标记鉴定

本研究对前期发现的2个新颖多年生大紫花单株(V-HNYZ-bV-1和W-SXXA-bV-1)和1个二年生白花丹参(Salvia miltiorrhiza)栽培居群(W-SCHY-W-1)材料,进行了基于其rDNA内、外转录间隔区(ITS和ETS)的分子标记鉴定。结果表明:W-SXXA-bV-1和V-HNYZ-bV-1的ITS的GC含量均较高,W-SCHY-W-1的ITS和ETS的GC含量最低;新颖材料W-SXXA-bV-1和V-HNYZ-bV-1的ITS序列变异率较高,均高于W-SCHY-W-1,而对于ETS序列,W-SXXA-bV-1和V-HNYZ-bV-1接近(7.1%~6.5%),但低于W-SCHY-W-1(8.2%);W-SXXA-bV-1与V-HNYZ-bV-1亲缘关系较近,W-SXXA-bV-1、V-HNYZ-bV-1和W-SCHY-W-1均与Q-DZH-V-4亲缘关系较远,V-HNYZ-V-1与Q-DZH-V-4亲缘关系很近。上述结果与栽培形态观察结果都高度一致表明:W-SXXA-V-1和V-HNYZ-V-1是康定或甘西鼠尾草,新颖单株材料W-SXXA-bV-1可能为W-SXXA-V-1的突变体,V-HNYZ-V-1和Q-DZH-V-4同为荔枝草,V-HNYZ-bV-1可能为混杂在V-HNYZ-V-1中的康定或西藏鼠尾草,与W-SXXA-bV-1非常相似。W-SCHY-W-1为粘毛鼠尾草。

广西山药炭疽病病原菌的鉴定与ITS序列分析

本文对山药炭疽病在广西的危害、症状特点以及病原菌的鉴定进行了研究。2005年从广西5个病区采集的25个标样均分离到类似的分离物,根据病原菌的形态特征和致病性,并结合其rDNA-ITS区域的序列分析,将广西山药炭疽病的病原菌鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

利用松茸ITS特异性引物对松茸分离物进行鉴定

利用一对ITS通用引物 (ITS4 ITS5 )和一对松茸物ITS特异性引物 (TMF TMR)对来源于云南省不同地区的 6个松茸 (Tricholomamatsutake)子实体及其 6株分离物 ,3个假松茸(Tricholomabakamatsutake)子实体及其 3株分离物、侧耳 (Pleurotusostreatus)、金针菇 (Flam mulinavelutipes)和双孢蘑菇 (Agaricusbisporus)的子实体进行了PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果表明ITS4 ITS5能将所有的样品扩增 ,并得到 6 0 0bp左右的DNA扩增条带 ,TMF TMR扩增时 ,只有松茸子实体及其对应分离物有扩增条带 ,DNA片段大小在 5 0 0bp左右。进一步对松茸子实体 (TG2 5 )及其分离物 (TM2 5 112 2 )进行ITS序列测定表明两者的DNA同源性为 10 0 % ,从而证明所分离到的 6个菌株确为松茸的纯培养物。

百合枯萎病病原鉴定与ITS序列分析

对从百合枯萎病病株上分离得到的病原菌进行形态特征、致病性以及核糖体DNA-ITS序列分析。结果表明,该菌在PDA培养基上气生菌丝白色绒毛状,小型分生孢子卵圆形或椭圆形,大型分生孢子镰刀形。克隆分析菌株的核糖体DNA-ITS区域序列,分离菌与GenBank中尖孢镰刀菌的ITS序列同源性最高达99.8%,仅有1个碱基的差异,进一步证实嵩明百合种植基地百合枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用

目的:通过对3株真菌的rDNA-ITS序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA基因(即rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)的多态性的序列分析(rDNA-ITS序列分析)在真菌鉴定中的应用。方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA-ITS序列,从GENBANK获取相似序列,使用BLAST和DNAMAN工具对rDNA-ITS序列进行比对分析。结果:1号真菌菌株与Xylariales sp.LM40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penicillium oxalicum;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母III组(最新命名为Candida metapsilosis)。结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA-ITS序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。

龙眼属rDNA的ITS序列分析

为了讨论龙眼属(Dimocarpus Lour.)的遗传多样性及鉴别技术,运用克隆测序法测定了主产区龙眼(Dimo-carpus longan Lour)品种及其近缘种龙荔[Dimocarpus confinis(Howet Ho)H.S.Lo.]的核糖体DNA中的内转录间隔区(ITS)序列(包括ITS1,5.8S和ITS2)。结果表明,龙眼及其近缘种龙荔的ITS区序列的长度范围为618～646 bp,长度变异为28 bp;其中,ITS1和ITS2的长度范围分别为227～235 bp和227～247 bp。龙眼品种间ITS序列变异位点比较丰富,通过单个或组合变异位点可以作为特异位点用于品种之间的鉴别。龙荔的ITS序列变异较大,在609处插入一个19个碱基的片段;系统发育树也表明龙荔自为一单树系,为其是龙眼近缘种提供了新的分子证据。结果还表明龙眼果实香味、流汁程度和质地与基于ITS序列的系统发育树结果表现较多品种的吻合性。

rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估

目的评价内转录间隔区(ITS)的多态性序列分析(rDNA-ITS序列分析)对临床少见丝状真菌的鉴定作用,以形态学鉴定方法加以补充验证。方法将3株待检真菌通过聚合酶链反应(PCR)扩增和基因测序方法分析rDNA-ITS序列,从GenBank获取相似序列,使用BLAST工具对rDNA-ITS序列进行对比分析,利用GenBank中的系统发育软件自动生成系统,构建系统发育树,根据系统发育树并结合对比指标确定距离与同源性均有较大鉴定意义的对比序列,并与真菌ITS1、ITS2、26S rDNA D1/D2片段的序列分析结果及形态学鉴定结果进行比较。结果 2株菌株能通过rDNA-ITS序列分析的方法鉴定到种,另1株由于相似序列较多,需要形态学方法加以配合鉴定。rDNA-ITS序列分析相对真菌ITS1、ITS2、26S rDNA D1/D2片段有更好的真菌鉴定作用。结论相对于传统形态学方法,利用rDNA-ITS序列分析鉴定丝状真菌不受检验人员经验水平影响,较为客观,同时由于其包含的信息量相对丰富,因此,较其他靶序列具有更好的真菌鉴定作用。但该方法也存在一定局限,因此,仍需结合形态学方法进行鉴定。

基于rDNA ITS序列分析的桑黄真菌菌株分子鉴定

对6份桑黄真菌菌株的rDNA ITS区段进行克隆测序和序列特征比较分析,并与GenBank中获得的桑黄基源物种相关序列进行同源性比对,进一步将从GenBank检索获得的桑黄基源物种的ITS序列、复合外组ITS序列连同6份桑黄菌ITS序列一起作系统发育分析。结果表明:Sh-03、04、05、06与Phellinus linteus亲缘关系最近,Sh-01与Phellinus baumii亲缘关系最近,Sh-02与Phellinus baumii、Phellinus linteus、Phellinus igniarius的亲缘关系相差甚远,为一错误菌种。本实验的研究结果可以提供一种准确可靠且简单易行的桑黄真菌分子鉴定技术。

火龙果炭疽病病原鉴定与ITS序列分析

为对火龙果炭疽病病的防治提供理论依据,对从火龙果炭疽病病株上分离得到的病原菌进行形态特征、致病性以及核糖体DNA.ITS序列分析。结果表明,引起火龙果炭疽病的炭疽菌有2种,一种分生孢子为镰刀形,该菌在PDA培养基上PDA培养基上菌落生长圆形,呈莲花状;另一种分生孢子为椭圆形,PDA培养基上菌落生长圆形。克隆分析菌株的核糖体DNA.ITS区域序列,弯孢病原菌与C.truncatum的菌株同源性高达100%,直孢病原菌与C.gloeosporioides的菌株同源性高达100%,结合形态学鉴定引起火龙果炭疽病病原菌为半知菌亚门腔孢纲黑盘孢目炭疽菌属(Colletotrichum)的C.truncatum和C.gloeosporioides。

ITS基因测序分析对89株病原真菌鉴定的应用评价

目的探讨内转录间隔区(ITS)基因扩增测序技术在病原真菌鉴定中应用价值。方法应用通用引物ITS1和ITS4对收集的89株真菌(包括酵母菌标准菌株6株,室间质评菌7株,临床分离的酵母样真菌42株和丝状真菌34株)进行PCR扩增和基因测序。测序成功的ITS序列在CBS数据库(http://www.cbs.knaw.nl/Collections)进行序列比对,结合Mycobank(http://cn.mycobank.org/)分类信息以获得其菌种鉴定信息。结果 89株不同种类的真菌均成功扩增到ITS靶基因,经测序,89株真菌均获得扩增的全序列。序列比对结果显示,6株酵母菌标准株中,5株鉴定到种,1株鉴定到属;7株室间质评株中,1株酵母菌鉴定到种,6株丝状真菌中2株鉴定到种,1株鉴定到属,3株鉴定到复合群;42株临床分离的酵母样真菌中,39株鉴定到种,3株鉴定到属;34株临床分离的丝状真菌中,10株鉴定到种,18株鉴定到属,6株鉴定为复合群。结论通用引物ITS1和ITS4广谱性强。ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定临床疑难真菌,但仍存在数据分析过程烦琐和结果解释困难的问题。

ITS2条形码对白及属植物的初步分析研究

本研究通过ITS2条形码对云南白及本地种的分布情况初步了解,并对药用白及和云南本地种进行分析研究。选取滇东南、滇东北、滇西北、滇西的材料,进行DNA提取、PCR、测序,MEGA 5.1软件进行序列比对、NJ系统聚类树构建,并预测ITS2二级结构。结果表明:药用白及和本地种ITS2序列之间存在明显差异,在NJ树上分别聚为两类。ITS2可以区分药用白及和本地种,且可以作为初步分析药用白及真伪的潜在条形码。

油茶叶枯病原的形态及ITS序列分析鉴定

对一株引起油茶落叶的叶枯病菌进行分离鉴定,为防治该病菌奠定基础。从油茶叶枯病斑中分离得到一株优势菌,通过对其形态特征的观察及rDNA的转录间隔区(ITS)序列测定,并与Genbank中同源性较高的菌株构建系统发育树,最后确定该菌株为拟盘多毛孢属菌,且与小孢拟盘多毛孢菌亲缘关系最近。

一株大豆腐霉菌(PSHH1)rDNA的ITS序列鉴定

大豆腐霉菌是黑龙江省大豆根腐病菌群的重要组成部分,为了明确大豆腐霉菌的种类,从黑龙江省黑河市大豆根系土壤分离获得1株腐霉菌PSHH1,应用r DNA-ITS序列分析法对其进行菌种鉴定。Blast和系统进化树结果表明:PSHH1与Gen Bank上登录号为AB259316.1和AB512973.1等的Pythium sylvaticum亲缘关系最近,r DNA-ITS序列同源性大于99%,因此认定PSHH1为Pythium sylvaticum。为了考察PSHH1的致病性,选取了60份当前大豆主栽品种,应用种子腐烂法和下胚轴接种法进行回接试验,通过计算种子腐烂率和植株茎折率来评价PSHH1的致病性,结果显示,PSHH1仅对13.33%的大豆主栽品种表现出较强的致病力,而对61.67%的大豆主栽品种致病力较弱。

基于rDNA ITS序列的何首乌PCR-RFLP分子鉴别

对何首乌及其常见混淆品的核糖体DNA内转录间隔区（rDNAITS）序列进行了测序分析．结果表明：何首乌与其混淆品毛脉蓼、翼蓼及耳叶牛皮消ITSI区的差异率分别为6．91％、18．10％和42．20％，ITS2区的差异率分别为10．00％、19．40％和43．90％；而何首乌种内各居群间ITS1和ITS2区的差异率分别为0．00％～2．13％和0．00％～1．03％．基于何首乌及其混淆品的rDNAITS序列的差异，找出一个位于ITS2间隔区的何首乌特征性M6I酶切位点，用M6I酶对何首乌rDNAITS序列扩增产物酶切后得到含约531bp和109bp的两片段的聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）图谱，而其混淆品的rDNAITS序列扩增产物不能被NsbI酶切，故图谱呈单一条带．利用建立的PCR．RFLP方法可以很好地区分何首乌及其混淆品．

高良姜及其混淆品rDNA ITS序列的分析与鉴别

用聚合酶链式反应(PCR)直接测序法测定和分析不同产地野生和农家品种的高良姜及其3种混淆品(山姜、华山姜和大高良姜)的核糖体DNA内转录间隔区(rDNAITS)序列,为高良姜种质资源研究和真伪鉴别提供分子数据.ITS序列分析结果表明:高良姜种内序列同源性达100%,测序结果中发现杂合位点,且广西样品杂合位点的两个碱基所占的比例与其它地方样品的不同.高良姜及其混淆品经测序、比对、排序得到的812 bp序列中有61个变异位点,60个是信息位点,同源性达96.32%,其中ITS1和ITS2区中的11个位点在高良姜及其混淆品中差别明显,可以鉴别高良姜及其混淆品.同时发现,基于DNA序列的高良姜及其混淆品的系统分类结果与形态学的分类结果不完全一致,有待进一步研究探讨.

rDNA-ITS2应用于赤眼蜂分子鉴定的研究

本研究通过对拟澳洲赤眼蜂 Trichogramma confusum、甘蓝夜蛾赤眼蜂 T. brassicae、广赤眼蜂 T.evanescens、食胚赤眼蜂 T. embryophagum,及松毛虫赤眼蜂 T. dendrolimi的 6个地理种群的 r DNA- ITS2进行克隆测序 ,又运用软件 DNAStar的 Meg Align程序对不同赤眼蜂属间、赤眼蜂属种间、同种不同地理种群之间以及同一赤眼蜂个体不同拷贝之间的 ITS2序列的遗传分歧及相似性进行了分析。结果表明 :赤眼蜂属与外群 ITS2序列的遗传相似性很低、赤眼蜂属内不同种之间 ITS2序列保守性适中、种内或不同地理种群之间以及同一个体不同 ITS2拷贝间非常保守。说明

5种鳎科鱼类核糖体ITS1序列比较

核糖体基因在很长一段时间内被认为严格遵循协同进化方式,但是在很多种类中都发现了明显的序列多态性,表明其是非协同进化。为了检测鳎科鱼类核糖体内转录间隔区1(ITS1)序列是否存在多态性,并探究其能否作为种类鉴定的分子标记,本研究克隆获得了5种鳎科鱼类共118条ITS1全序列。结果显示,眼斑豹鳎具有两种差异显著的片段类型,表明其在基因组中遵循非协同进化方式;而在其余4种鳎科鱼类中均没有发现序列多态性,表明其为协同进化。序列分析显示ITS1具有明显的种间长度异质性,最短的序列出现在蛾眉条鳎(412 bp),最长的为眼斑豹鳎(585 bp)。碱基分析显示ITS1序列在5种鳎科鱼类中都呈现出相同的趋势:C>G>A>T,且GC含量为69.5%,远高于AT含量。聚类分析显示除眼斑豹鳎外,所有鳎类均单独聚为一支,种类区分度非常明显,表明ITS1序列能够作为种类鉴定的分子标记。但是眼斑豹鳎的一个克隆和东方箬鳎聚为一支,这种序列多态性对种类鉴定产生了干扰,因此用具有多态的ITS1序列作为分子标记时一定要有足够的克隆数量,避免因数据不充分而得到不正确的结论。

云南万寿菊叶斑病病原菌的鉴定与ITS序列分析

为明确云南万寿菊叶斑病病原菌种属分类地位,对采自云南蒙自的万寿菊叶斑病病叶,依据科赫法则进行分离、纯化、回接和再分离,证明获得的分离物是叶斑病的致病菌。对其形态特征和培养性状进行观察,并对核糖体DNA-ITS序列进行分析。结果表明,致病菌株在PDA培养基上呈灰褐色;分生孢子梗直立或弯曲,有隔膜;分生孢子倒棒形或卵形,有纵、横隔膜,无喙或具短喙。核糖体DNA-ITS序列与GenBank数据库芸苔生链格孢同源性高达100%。将云南万寿菊叶斑病的病原菌鉴定为芸苔生链格孢Alternaria brassicicola。

ITS鉴定真菌病原:一例司法鉴定研究实例

本研究选择一例疑似空气污染物伤害松树的司法鉴定案作为研究实例,在现场勘察和初步形态鉴定的基础上,应用ITS序列分析鉴定了对疑似空气污染物伤害松树的病原做了分子鉴定。我们对委托鉴定的疑似空气污染物伤害松树的地及周边地区进行了勘查,现场勘查结果并不支持空气污染物伤害松树的看法。为明确松树枯死的原因,对取样病枝上的疑似病原物进行了显微镜观察和培养性状观察,根据显微镜下孢子的形态和病原菌的培养性状,初步判断导致马尾松枯死的病原可能为拟盘多毛孢属(Pestalotipsis)真菌。为进一步确定病原种类,我们应用分子生物学技术对危害马尾松的病原物进行了ITS分子鉴定。测定了疑似真菌的ITS序列,并进行了比对和系统发育分析。研究结果表明,导致松树枯死的病原菌系韦司梅拟盘多毛孢(Pestalotipsis vismiae)。在本研究案例中,利用真菌ITS序列的系统发育分析,快速、准确地鉴定了真正导致松树枯死的病原,为今后类似司法鉴定案件审理提供了证据鉴定的新手段。