供体细胞来源和TSA处理对牦牛iSCNT胚胎重编程的影响

【目的】探讨不同来源的供体细胞和TSA处理对牦牛异种体细胞核移植(Interspecies nuclear trans-fer,iSCNT)胚胎的影响。【方法】以黄牛卵母细胞为受体,分别以牦牛50日龄胎儿及6和18月龄个体成纤维细胞为供体,构建牦牛iSCNT胚胎,研究供体细胞来源对牦牛iSCNT胚胎的影响。分别用0(对照),20,40,60和80nmol/L的TSA处理50日龄胎儿成纤维细胞12h,构建iSCNT胚胎,比较其发育情况,确定TSA的最佳处理浓度;用最佳浓度的TSA处理50日龄胎儿成纤维细胞0(对照),6,12和18h,构建iSCNT胚胎,比较其发育情况,确定TSA的最佳处理时间。用最佳TSA作用时间和浓度处理供体细胞,构建牦牛iSCNT,之后用40和80nmol/L的TSA分别处理iSCNT胚胎6和12h,比较不同处理方式对牦牛iSCNT胚胎发育的影响。采用qRT-PCR方法检测40nmol/L TSA处理供体细胞6h的iSCNT胚胎及40nmol/L TSA处理供体细胞6h且处理iSCNT胚胎12h的iSCNT胚胎去乙酰化酶2(HDAC2)基因mRNA的表达水平,以不进行TSA处理的iSCNT胚胎为对照。【结果】以50日龄胎儿成纤维细胞作为供体细胞,牦牛iSCNT胚胎的囊胚率最高,但与其他组差异不显著(P>0.05)。40nmol/L TSA处理供体细胞6h能显著提高牦牛iSCNT胚胎的囊胚率(30.6%),且与对照组差异显著(P<0.05)。用40nmol/L TSA处理牦牛iSCNT胚胎12h组的囊胚率高于80nmol/L TSA处理iSCNT胚胎6h组,2组间差异不显著(P>0.05)。用TSA处理供体细胞和iSCNT胚胎之后,HDAC2mRNA表达水平降低,且与对照组差异显著(P<0.05)。【结论】不同来源的供体细胞对iSCNT胚胎发育的影响不明显;40nmol/L TSA处理供体细胞6h和iSCNT胚胎12h能显著提高牦牛iSCNT胚胎体外发育及重编程能力。

猪体细胞克隆胚胎的体外生产试验

【目的】通过优化猪体细胞核移植程序,建立获得克隆囊胚的有效方法。【方法】比较不同电激活参数、不同体外培养条件对猪体细胞克隆胚发育能力的影响。【结果】选用1.5kV·cm-1、80μs和1DC的参数组合,对猪核移植重构胚进行电融合和电激活,可获得较高的卵裂率和最高的囊胚发育率(分别为71.4%和14.3%),且囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05);0.4%BSANCSU23培养液培养克隆重构胚72h,半量换液并未改善克隆胚的发育,但添加10%FBS可显著提高囊胚发育率(15.1%对10.3%,P<0.05)和DNA完整率(56.8%对46.6%,P<0.05);采用猪卵泡颗粒细胞(pGC)共培养体系未能显著提高克隆胚发育率(P>0.05),但卵丘细胞(pCC)单层共培养时,囊胚发育率显著高于对照组(16.7%对9.8%,P<0.05),培养5d的克隆胚凋亡率也显著低于对照组(39.5%对54.2%,P<0.05)。【结论】采用1.5kV·cm-1、80μs和1DC的参数组合对猪克隆重构胚进行电融合和电激活,以0.4%BSANCSU23培养液作pCC单层共培养72h,然后换用10%FBSNCSU23培养液,可明显提高囊胚发育率。

蛋白酶抑制剂MG-132对牛核移植重构胚重编程的影响

旨在探讨MG-132对牛体细胞核移植重构胚重编程的影响。将牛卵母细胞体外培养至MI期,添加不同浓度的MG-132(0、3、5、7、10μmol·mL-1),至成熟后进行激活,通过胚胎的发育情况得出MG-132的合适浓度,并用此浓度的MG-132作用于核移植全过程,来研究MG-132的作用,用免疫组化的方法进一步验证结果。结果,5、7μmol·mL-1MG-132组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组和2μmol·mL-1组(P<0.05),但这2组间无显著差异(P>0.05),而10μmol·mL-1组卵裂率只有23.44%,低于其他各组(P<0.05);成熟卵母细胞在5μmol·mL-1MG-132中分别作用0、2、4h激活后,卵裂率、囊胚率均无显著差异(P>0.05),而6h组激活后卵裂率、囊胚率均明显降低(P<0.05);核移植操作过程中添加MG-132组的卵裂率与对照组相比无显著差异(P>0.05),而桑葚胚和囊胚率都较对照组显著升高(P<0.05);未添加MG-132组,融合后1h供体细胞几乎无变化,4h后核纤层蛋白(lamin)着色显著,说明染色体凝集不完全;添加组融合4h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。上述结果说明5μmol·mL-1MG-132能够促进重构胚的重编程,但对重构胚移植后的附植和妊娠作用还有待进一步研究。

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h和56h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚。研究结果表明,成熟44h的卵母细胞核移植后有较高的融合率(58.99%)、卵裂率(67.52%)和囊胚率(22.78%),而成熟48h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40h、36h、32h、28h的卵母细胞的分裂率与囊胚率(P<0.05)。卵龄为48h的卵母细胞融合率高于卵龄为52h卵母细胞的融合率(P<0.05)。同时我们还探讨了不同去核方法(盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system)对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响。研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%。Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率(P>0.05),而与Spindle-view法去核率没有差异(P>0.05)。三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著(P>0.05),但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著(P<0.05)。进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著(P<0.05);两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考。

不同电融合条件对莎能奶山羊转基因(GFP)核移植胚胎发育的影响

以莎能奶山羊(Saanen dairy goat)转基因(GFP)成纤维细胞为核供体细胞,以普通山羊卵母细胞为受体细胞进行了核移植,试验中对转基因核移植胚胎的电融合条件进行了优化,发现对于莎能奶山羊转基因(GFP)重构胚胎的处理,电融合时方案B(1.5kV/cm、30μs/次、间隔1s)电融合参数最适合用于莎能奶羊的转基因(GFP)核移植胚胎,其重构卵电融合率为89.4%,重构胚分裂率为68.0%。

电融合条件对新疆盘羊(Ovis ammon)和转基因(GFP)萨能奶山羊核移植胚胎发育的影响

以新疆野生盘羊(Ovis ammon)和萨能奶山羊转基因(GFP)成纤维细胞为核供体细胞,分别以绵羊卵母细胞和普通山羊卵母细胞为受体细胞进行了核移植,对不同种类核移植重构卵进行电融合处理,发现盘羊重构卵电融合参数为1.4 kV/cm、20μs/次、间隔1 s时的重构卵融合率最高;对于转基因(GFP)萨能奶山羊重构卵的处理,电融合前先放入融合液中于38.5℃下平衡5 min,融合时电融合参数为1.5 kV/cm、20μs/次、间隔1 s时的融合率最高。实验中发现将融合后的两种重构胚胎先置入IVM培养液中于38.5℃下平衡4 h,可降低重构胚胎的死亡率,提高发育质量和卵裂率。

哺乳动物的克隆技术——哺乳动物克隆的原理、方法、影响因素及存在的问题

哺乳动物细胞克隆是20世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,该技术对于优良种畜的复制、减少试验用动物数目、动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育等方面具有重要意义。近年来克隆技术发展迅速,多种哺乳动物相继克隆成功,但也存在克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常的问题。作者阐述了动物克隆的基本原理、操作方法及其相关影响因素,提出了解决相关问题的关键。

哺乳动物异种体细胞核移植技术的应用及影响因素

哺乳动物异种体细胞核移植技术是在同种细胞核移植技术基础上发展起来的动物生殖技术,其在濒危动物保护、人类胚胎干细胞及生物基础学科研究等方面已展现出美好的前景。目前,该技术处于发展阶段,还存在很多值得研究的问题。文章介绍了动物异种体细胞核移植技术在国内外的研究现状,分析了影响异种体细胞核移植技术发展的因素,并对该技术的发展前景进行了展望。

不同融合液对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

[目的]探寻适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液。[方法]用延边黄牛颗粒细胞为供体细胞。试验1,比较3种浓度(0.25、0.280、.30 mol/L)3种融合液(蔗糖、D-山梨醇、甘露醇)对核移植胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。试验2,比较3种0.28 mol/L融合液对核移植效率的影响。[结果]3种浓度的蔗糖、D-山梨醇、甘露醇融合液的融合率和卵裂率差异均不显著,但0.28 mol/L融合液处理的重组胚后期发育相对较好。3组融合液融合率(88.44%、86.83%、86.85%)差异不显著,蔗糖、甘露醇融合液卵裂率(87.98%、86.06%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(78.64%);蔗糖、甘露醇融合液囊胚发育率(22.16%、19.91%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(10.14%)。[结论]适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液为0.28 mol/L蔗糖融合液。

一种特殊的实时图象处理──圆环图象展开

作者在文中给出了一种将圆环域图象展开成矩形图象的方法。这种方法主要采用八分之一圆扫描方法 ,快速找出某个圆的所有象素 。

小鼠-猪种间核移植胚胎玻璃化冷冻保存

以小鼠卵丘细胞为供核细胞,猪体外成熟去核卵母细胞为受体,构建小鼠-猪种间体细胞核移植(iSCNT)胚胎,并以猪体细胞核移植(pSCNT)胚胎为对照,采用开放式拉长细管(OPS)法对所获iSCNT胚胎进行冷冻保存,研究不同冷冻保护液(ES、EFS和EDFS)及胚胎不同发育阶段(2-、4-、8-细胞)对冷冻效果的影响。结果显示:小鼠-猪iSCNT胚胎卵裂率与猪pSCNT胚胎相比无显著差异(P>0.05),但其8-细胞发育率则明显较低(28.1%对56.8%,P<0.05)。采用ES液作为冷冻保护液,iSCNT胚胎冻后存活率与EDFS组相似,但显著高于EFS组(28.6%和22.7%对9.5%,P<0.05);与其他发育阶段相比,2-细胞期小鼠-猪iSCNT胚胎可获得最高的冻后存活率;小鼠-猪iSCNT各期胚胎的冻后存活率均低于pSCNT组,但无统计学差异(P>0.05)。结果表明,以ES液为冷冻保护液,选择2-细胞期小鼠-猪iSCNT胚胎进行OPS法冷冻保存,可获得相对较高的冻后存活率,但iSCNT胚胎的冻后存活率和体外发育能力均较pSCNT胚胎低。

梅山猪耳组织成纤维细胞及其处理对核移植重组胚发育的影响

为研究供体细胞不同处理方法对核移植重构胚发育能力的影响,分别用血清饥饿不同时间和传代次数的供体细胞进行核移植,比较重组胚的卵裂率和囊胚率。结果发现,饥饿0、2、4、8d的核供体细胞,重组胚在卵裂率上没有表现显著的差异,而饥饿2d和4d试验组的囊胚率却显著高于其他组;以传代0、2、4、8代的细胞作为供体细胞进行核移植,未经传代的细胞直接作为核供体卵裂率为57.69%,明显低于经过传代的细胞;细胞的传代次数在重组胚卵裂率上并未表现出明显的不同,但传至第4代细胞构成重组胚的卵裂率和囊胚率最高(86.29%和23.36%)。试验选取饥饿处理2d、传4代的成纤维细胞作为核移植的供体,挑选发育良好的重组胚移植到6头代孕母猪体内,3头代孕母猪在第1到第3个情期相继返情,1头在胚胎移植45d流产;2头没有返情,B超检查受孕,其中1头代孕母猪到预产期顺利产下6头健康胎儿。

牛兔异种体细胞以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆研究

随着同种动物克隆后代的不断降生,人们又开始尝试异种动物体细胞核移植。用兔的卵母细胞作为核受体进行牛的体细胞核移植,研究表明,颗粒细胞作为供核体与兔去核卵母细胞的融合率(60.5%,57.9%)稍高于皮肤成纤维细胞的融合率(52.2%,48.4%),但两者间差异并不显著。颗粒细胞与皮肤成纤维细胞均采用饥饿培养和接触抑制培养两种不同的方式进行诱导处理,融合卵在电激活后能够卵裂并发育的情况差异显著(72.6%对51.4%;70.4%对52.2%)。有少数重构胚发育至囊胚,证明在哺乳动物异种重构胚早期发育中,异种细胞核与细胞质间是相容的。

异种动物核移植研究进展

异种核移植作为新型发展起来的动物繁殖技术 ,在畜牧生产、医学、生物学领域愈来愈表现出其巨大的价值。人们以前已经进行了一系列的探索 ,如在供体细胞方面 ,人们尝试使用了包括肝脏细胞、乳腺细胞在内的各种类型的细胞 ,并采取各种措施处理供体细胞 ;而对于受体细胞多采用卵泡 -卵丘复合体进行体外培养或通过超排获得 ;比较各种融合方法 ,目前多采用电融合方法 ,也较化学融合、病毒介导融合等方法简单 ;至于重构胚的培养则多采用培养液体外培养的方法 ,此方法操作简单 ,也比较容易观察记录实验过程。

哺乳动物异种核移植的研究进展

异种核移植是在同种核移植基础上发展起来的动物生殖技术,在生物学研究方面具有重要的理论价值,如研究核质相互作用。同时,异种核移植在畜牧业生产、医学临床和濒危动物拯救等方面具有独特的意义。目前,异种核移植技术还处于探索发展阶段,还有许多问题需要研究解决。文章介绍了哺乳动物异种核移植技术发展的历史、研究的热点、现状与取得的成果。同时,分析了影响异种核移植的因素、尚未解决的问题和该技术的发展和应用前景。

哺乳动物线粒体遗传和在体细胞克隆胚胎中的命运

线粒体是哺乳动物重要的细胞器之一,为细胞的生命活动提供能量。线粒体是除细胞核外唯一含有功能性基因组DNA的细胞器。由于线粒体在哺乳动物早期胚胎的发育中有多方面重要的作用,因此线粒体对体细胞克隆胚胎发育的影响成为体细胞克隆动物研究的热点。就线粒体的结构特点和遗传特性及其在同种、异种动物克隆早期胚胎发育过程中的命运以及可能的遗传机制进行综述。同时,也将比较注射异源线粒体后,线粒体在注射胚胎中的发育命运。

哺乳动物核质重组胚后成性重序的机制

研究表明,供体核不完全或者不正确的后成性重序可能是核移植失败的主要原因。文章综述了哺乳动物核质重组胚中存在的几种不同的后成性重序机制,包括DNA甲基化、染色质重构、基因组印记与X染色体失活、端粒维持以及其他后成性遗传机制。理解重组胚后成性重序的机制将有助于我们解决核移植技术中存在的问题,进而促进它的应用。

小鼠第一极体基因组移植的时间窗探索

目的以杂交一代(BDF1)小鼠为模型,探索小鼠第一极体基因组移植(PB1T)的最佳时间窗,提高第一极体基因组移植重构胚存活率和体外发育能力,为临床研究和应用提供前期动物实验基础。方法获取注射人绒毛膜促性腺激素(h CG)后12.5、13.5、14.5、15.5 h 4个时间点的MII卵子作为实验组。分别取第一极体作为核供体,取h CG后14h的MII卵子,去除纺锤体染色体复合物后作为胞质供体,构建四组第一极体基因组移植重构胚。获取MII卵子进行体外受精并培养作为对照组(IVF组)。体外培养并观察实验组4组重构胚以及对照组卵子存活情况、体外受精、卵裂和囊胚发育情况。结果在4组实验组中,13.5 h组的PB1T重构卵子的存活率、体外受精率、2-细胞形成率、4-细胞形成率和囊胚率均最高,与IVF对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。14.5 h组的重构卵子的存活率、体外受精率和后续发育率稍低于13.5 h组,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。15.5 h组的重构胚体外受精率和囊胚形成率均最低(76%、41.7%),与对照组相比差异有统计学意义(P=0.020 0,P=0.005 7)。结论 BDF1小鼠h CG后13.5 h和14.5 h的卵子的第一极体基因组在新的供体胞质中能够更好地重建发育潜能,行PB1T可能的最佳时间窗为h CG后13.5~14.5 h。

奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化

通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。

哺乳动物体细胞核移植技术研究进展

体细胞核移植技术具有十分诱人的应用前景 ,在农业、物种保护、医疗等领域已显示出优越性。然而核重构等核移植基础理论方面的研究还很薄弱 ,致使核移植技术还不很完善 ,克隆动物还存在着甲基化酶异常调节、不正确的印迹基因表达、X染色体异常激活等错误的表观遗传现象 ,移植成功率较低 ,在一定程度上限制了它的发展。根据近几年的研究进展 ,对核移植技术的应用。