改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,为组织工程支架研究提供细胞基础。方法分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法,对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中,将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性,流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化,并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能,通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一,细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜能,为组织工程支架的研究奠定了细胞基础。

原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景:增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。目的:建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。方法:采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。结果与结论:组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40d可传第1代,以后每7-10d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。

人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定

从建立体外循环将进行心脏手术的风湿性心脏病患者体内无菌下取心脏停跳前右心耳组织,采用组织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分离培养,通过光学显微镜观察培养后的细胞形态,并通过免疫细胞化学的方法鉴定所分离培养的细胞。贴壁4—6d后可见长梭形贴壁生长的细胞游离出组织块,细胞生长迅速,2—3d后即呈融合状态,细胞排列紧密,有的交叉重叠生长,胞体较大,细胞浆透明,细胞核较大,呈椭圆形,无自发性搏动。免疫细胞化学检测显示所培养细胞波形蛋白呈阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。

改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞

目的建立改良前处理的原代组织块贴壁法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)。方法将SD大鼠经颈椎脱臼处死断头后放入盛有75%酒精的烧杯中浸泡消毒。在无菌条件下剖开胸腹腔,取出大鼠的心肺组织,然后用非体式显微镜分离方法分离出肺动脉血管段,去除肺动脉血管外层纤维结缔组织、破坏血管内膜层内皮细胞后,用组织块贴壁法培养PASMCs,并传代、冻存和复苏,倒置相差显微镜观察细胞形态,普通免疫细胞化学法和免疫荧光法进行细胞鉴定。结果大鼠PASMCs呈典型的"峰-谷"样生长状态,细胞形态呈梭形。α-SM actin蛋白在培养的大鼠PASMCs为阳性表达,传至第4代的PASMCs成活率可达98%,生长形态未见异常改变。PASMCs细胞从-80℃冰箱中取出复苏后,生长状态良好,形态、结构稳定。结论用改良前处理的组织块贴壁法能够成功培养PASMCs,较传统组织块贴壁法更简单,培养效率高。

原代SD大鼠主动脉内皮细胞培养方法的建立及其鉴定

目的:建立一种简便高效的原代SD大鼠主动脉内皮细胞(AECs)培养方法,为探索AECs的分子生物学特性及开展心脑血管疾病研究提供重要的载体和工具细胞。方法:取SD大鼠1只,无菌打开胸腹腔,分离出主动脉,剔除血管外结缔组织和脂肪,将主动脉内膜外翻,切成长为1.0~1.5 mm的血管段后接种于培养瓶中,7 d后去除血管段继续培养。通过细胞形态表现观察和第Ⅷ因子(FⅧ)相关抗原免疫细胞化学染色鉴定目的细胞。结果:接种3 d后,有少量细胞从血管段周围迁移出,形成岛屿状细胞团;10~12 d后,细胞集落逐渐融合成片,铺满瓶底,呈典型的“铺路石样”镶嵌式排列。FⅧ相关抗原免疫细胞化学染色检测,细胞的胞核和胞质淡染成棕红色,表达为阳性,阳性细胞率达98%以上。结论:主动脉内膜外翻切段贴壁培养法能够成功分离培养出原代大鼠AECs。

成年鸡原代肝细胞的原位分离和长期培养

为探讨成年鸡原代肝细胞的分离条件和长期培养过程中的形态学特征,本试验采用改进胶原酶二步原位灌流法分离高活性鸡原代肝细胞,并优化培养液,得到肝细胞长期培养的初步条件。结果显示,分离得到的活性肝细胞达94%,培养3 d细胞活性最强;贴壁培养时可见到肝细胞较为明显的分化过程。