艾滋病猴特异性细胞免疫的胞内细胞因子检测方法优化与应用

目的为准确检测艾滋病猴模型特异性细胞免疫,优化、确定胞内细胞因子染色(ICS)影响因素和条件。方法使用三种多克隆激活剂分别刺激SIV感染猴外周血单个核细胞(PBMC),确定最佳阳性刺激物和刺激时间;然后使用五种浓度SIVmac239混合肽库分别刺激SIV感染猴PBMC,体外培养,不同时间点进行细胞染色和流式检测,确定肽库的最适刺激浓度和最佳刺激时间。最后,初步应用该方法检测SIV感染猴细胞免疫水平。结果 PMA+离子霉素组合可用作本实验的阳性刺激物;2μg/mL肽库,37℃5%CO2培养16 h,能更有效的刺激T细胞分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ。结论该方法的优化对艾滋病药物的临床前评价和疫苗研发等研究具有重要意义。

人类巨细胞病毒特异性CD8^+T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495503,NLV)特异性CD8+T细胞的功能特性。方法将HLAA2NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6h后分析γ干扰素(IFNγ)的表达水平。结果NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+T细胞分泌IFNγ,不同供者特异性CD8+T细胞产生IFNγ的比率存在较大差异(55.69±17.64)%,当NLV抗原肽质量浓度为10μgmL时IFNγ阳性细胞百分率最高;未经刺激的特异性CD8+T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%。结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+T细胞合成IFNγ和穿孔素的能力存在多样性。

胞内细胞因子染色中固定和打孔方法的选择

本文采用流式细胞仪分析三种固定 /打孔液以及胞内FcR封闭对胞内细胞因子染色结果的影响。结果显示 ,商品化fix/ perm固定 /打孔液条件稳定 ,多聚甲醛固定 +0 .1%saponin(PBS)打孔液在一定程度上可替代fix/ perm固定 /打孔液 ,并且有必要将胞内FcR进行封闭。

结核多肽特异性细胞内因子多色流式分析

目的建立能同时检测CD3、CD4、CD8表型及胞内因子IFN-γ、IL-4、TNF-α的多色胞内细胞因子染色流式细胞术;评价六条结核特异性多肽的性能。方法将结核患者组及健康对照组的PBMC,用结核特异性多肽或PMA刺激培养后,通过胞内细胞因子流式检测术,收集荧光标记阳性的淋巴细胞等;从而确定各亚群IFN-γ、IL-4、TNF-α阳性细胞的数量及百分率,得出两组间及各多肽间的性能差异。结果 1.各多肽均能刺激活化结核患者PB-MC产生IFN-γ等细胞因子,但百分率较低;IFN-γ及IL-4多数小于1%,而TNF-α则在大约10%左右。与对照组比较,IFN-γ及TNF-α的均值分别高1-12倍或1-3倍,IL-4+/CD4+T淋巴细胞活化率的倍数较小,而IL-4+/CD8+的倍数则较大;2.不同多肽刺激产生细胞内因子的比较:除多肽H256与H210活性能刺激CD4+亚群分泌更多IFN-γ外,其余各多肽刺激产生因子的性能无统计学差异;3.对于IFN-γ及IL-4因子,各多肽均无CD4+或CD8+亚群差异,但各多肽均可刺激CD8+细胞亚群产生更多TNF-α;4.双阳性(IFN-γ及TNF-α阳性)多功能T细胞分析,经多克隆刺激剂(PMA)活化后,IFN-γ+/CD4+及IFN-γ+/CD8+T细胞分别有83.0%及79.9%(均值)为双阳性细胞,而经多肽刺激后则为68.1%及65.7%(均值)。结论多色流式胞内因子染色能很好地检测特异性多功能细胞;所用的6条多肽均能活化结核特异性淋巴细胞产生细胞因子,但细胞因子的活化率较低。

宫颈癌NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应分析

目的探讨宫颈癌患者癌症-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)中纽约食管鳞状上皮癌抗原1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NY-ESO-1)的特异性T细胞免疫应答及其临床相关性,为其在宫颈癌免疫治疗中的初步应用提供科学依据。方法收集新疆医科大学附属肿瘤医院2018年8月-2019年6月收治的31例宫颈癌初治患者,用合成的NY-ESO-1抗原重叠肽刺激宫颈癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),采用胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)技术同时检测γ-干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)等5种细胞因子,FlowJo10.6流式细胞软件分析宫颈癌患者外周血T细胞亚群胞内细胞因子分泌和共表达水平,再结合临床资料分析其与宫颈癌患者临床特征之间的关系。结果(1)宫颈癌患者外周血对NY-ESO-1抗原肽刺激产生免疫应答率为67.4%(21/31),其中CD4+T细胞免疫应答阳性率为32.3%(10/31),CD8+T细胞免疫应答阳性率为54.8%(17/31)。(2)宫颈癌NY-ESO-1特异性CD4+T细胞免疫反应频率中无流产史者(63.6%)明显高于有流产史者(15.0%),二者差异有统计学意义(P=0.018);宫颈癌NY-ESO-1特异性CD8+T细胞免疫反应频率中≤52岁者(70.6%)明显高于>52岁者(35.7%),二者统计学差异为临界值(P=0.052)。结论NY-ESO-1抗原肽能在宫颈癌患者外周血中产生特异性T细胞免疫反应。

保存条件对恒河猴CD8^(+)T细胞活性的影响

目的通过细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)检测CD8^(+)T细胞反应强度,探究不同保存条件对CD8+T细胞活性影响。方法采集9只恒河猴外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),一部分新鲜细胞直接用于检测,剩余细胞冻存至-80℃和液氮,冻存1周和1年再用于检测,检测时用阳性刺激物进行刺激,流式分析活细胞比例,MIP-1β、TNF-α、IL-2、IFN-γ四种细胞因子分泌情况和细胞脱粒标志物CD107a的表达情况。结果随着冻存时间的增加,细胞存活率降低,且液氮冻存比-80℃冻存有更高的存活率。在细胞因子分泌和细胞脱粒标志物CD107a的表达情况中,冻存一年的细胞MIP-1β、TNF-α分泌量显著高于正常细胞,细胞状态发生了改变,冻存一周的细胞与新鲜细胞状态更为相近。结论想要保持低的细胞死亡率和正常的CD8+T细胞反应,应使用新鲜细胞或短期冻存的细胞进行测量CD8^(+)T细胞反应水平的实验。

Ⅲ-Ⅳa期鼻咽癌LMP特异性T细胞免疫反应与临床分析

目的探讨Ⅲ-Ⅳa期鼻咽癌EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)1、LMP2特异性T细胞免疫反应及临床意义,为鼻咽癌免疫治疗提供思路和依据。方法收集新疆医科大学附属肿瘤医院2018年2月至2020年10月初治的59例鼻咽癌患者,应用LMP抗原刺激外周血单核细胞,胞内细胞因子染色及流式细胞术研究CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞白细胞介素(IL)-2、IL-13、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)4种细胞因子的表达,并结合临床资料分析。结果鼻咽癌患者外周血T细胞对LMP1、LMP2反应阳性率存在差异。T_(3)-T_(4)期鼻咽癌患者LMP1特异性CD4^(+)T细胞阳性率明显高于T_(1)-T_(2)期患者(51.0%∶10.0%,P=0.042),LMP1和LMP2、CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞间部分细胞因子表达也存在差异。生存分析显示,2、3年OS率为91.5%、88.2%,2、3年PFS率为83.3%、75.3%;单因素分析提示吸烟史、男性、LMP1刺激CD4^(+)T细胞IL-13阳性表达是疾病的进展的危险因素(P=0.026、0.045、0.006);多因素分析显示LMP1刺激CD4^(+)T细胞IL-13阳性表达与吸烟史是局部晚期鼻咽癌患者PFS的独立危险因素(P=0.017、0.019)。结论LMP在鼻咽癌患者外周血中产生特异性T细胞免疫反应,不同T细胞亚群表达存在差异。LMP1、LMP2特异性T细胞免疫反应与原发肿瘤大小、转移淋巴结体积有关。LMP1刺激CD4^(+)T细胞IL-13阳性表达和吸烟史影响疾病的进展。

一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法

本研究旨在建立一种基于流式细胞术的牛多细胞因子检测方法。对前期制备并筛选出的针对牛细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10和MCP-1的单克隆抗体进行荧光标记,与细胞表面分子抗体组合搭配,进行牛多细胞因子流式检测方法的建立和优化。随后利用建立的方法进行BCG体外感染牛外周血单个核细胞的细胞因子表达规律测定,并结合CFP10-ESAT6蛋白刺激剂评价上述细胞因子作为牛结核诊断标识的潜力。建立的牛多细胞因子流式检测方法可以有效测定BCG感染牛外周血T淋巴细胞的细胞因子表达,其中IFN-γ、IL-2、TNF-α在感染40h后持续上升,而IP-10和MCP-1表达水平呈现下降趋势;对于牛外周血CD4^(+)T淋巴细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α的联合检测能有效区分牛结核阳性和阴性样品。这一方法为牛病原菌感染、疫苗注射后细胞免疫应答水平评价以及疫病诊断提供了重要技术手段。

磁珠分选系统和胞内染色法联合分析细胞因子诱导杀伤细胞中Th1/Th2细胞亚群分布特点

目的 评价以磁珠分选系统和胞内染色法联合分析细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)中Th1 /Th2细胞亚群分布特点,探讨胞内染色法的应用价值。方法 体外大规模扩增CIK,利用磁珠分离系统富集纯化CIK中的人白细胞分化抗原(CD)4+T细胞亚群。用胞内染色法分析其Th1 /Th2细胞亚群的分布特点。结果 经磁珠分离法富集的CD4+CIK细胞纯度高达96%,它与外周血单个核细胞(PBMC)相比变化显著,其中Th1 (IFN -γ+IL- 4 )亚群、Th0 (IFN -γ+IL- 4+ )亚群分别从( 1 .18±0. 94)%和( 0. 19 ±0. 16 )%升至( 33 .93 ±6 .38 )%和( 23. 07 ±8. 23 )% (P< 0 .01 ),而Th2(IFN -γIL- 4+ )亚群虽然从( 17 .56±16. 71 )%降至( 10 .21±7. 05 )%,但差异无统计学意义(P>0. 05)。结论 本试验提示CIK具有明显的“Th1优势”;磁珠分选系统和胞内染色法联合测定Th1 /Th2细胞亚群分布的方法简便快捷,结果稳定,适合临床应用。

抗马干扰素-γ单克隆抗体的异硫氰酸荧光素标记及应用

目的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗马干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体,为建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法提供实验材料。方法利用FITC标记纯化的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10),荧光抗体经系列稀释后,对马外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内细胞因子IFN-γ单染色的流式细胞术检测,同时与商品化FITC标记的抗牛IFN-γ单克隆抗体(CC302)进行流式细胞术检测对比试验。结果FITC-CC302染色马PBMC,1μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.35%,而FITC-SB10经系列稀释染色,在用0.25μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.90%。结论所制备的FITC标记的抗马IFN-γ单克隆抗体,可为建立马细胞免疫学研究方法奠定物质基础,进而为建立监测马机体免疫状态和研究机体免疫机制提供技术平台。

使用活化诱导标记法评价HIV-1感染者特异性CD4^(+)T细胞免疫应答的研究

目的:建立一种检测HIV-1特异性CD4^(+)T细胞亚群功能的活化诱导标记法(activation-induced markers,AIM),从而更有效地评价HIV-1抗原特异性CD4^(+)T细胞免疫应答水平。方法:选取12例未经抗病毒治疗的HIV-1慢性感染者及6例未感染HIV-1的健康人,分别以基于多色流式细胞术的AIM法和细胞内因子染色法(intracellular cytokine staining,ICS)检测抗原特异性T淋巴细胞功能,并探讨两种方法用于评价HIV-1感染者抗原特异性T细胞免疫应答的能力。结果:AIM法检测HIV-1慢性感染者中HIV-1抗原特异性PD-1^(+)CD25^(+)CD4^(+)T、CD69^(+)CD200^(+)CD4^(+)T、CD69^(+)ICOS^(+)CD4^(+)T细胞阳性的比例为11/12、8/12和7/12,检测CD69^(+)ICOS^(+)CD8^(+)T、CD137^(+)CD69^(+)CD8^(+)T、PD-1^(+)CD25^(+)CD8^(+)、OX40^(+)PD-1^(+)CD8^(+)T细胞阳性的比例为8/12、8/12、7/12、7/12。ICS法检测HIV-1抗原特异性IL-2^(+)CD4^(+)T、IFN-γ^(+)CD4^(+)T、TNF-α^(+)CD4^(+)T细胞阳性的占比为2/12、2/12、0;IFN-γ^(+)CD8^(+)T、TNF-α^(+)CD8^(+)T、IL-2^(+)CD8^(+)T细胞阳性的占比为12/12、10/12、5/12。结论:AIM法在评价CD4^(+)T细胞功能方面更为敏感,可作为ICS法的补充,两种方法联合使用可更全面地评估抗原特异性T淋巴细胞反应。

宫颈癌MAGE-A1特异性T细胞免疫反应分析

目的探讨宫颈癌患者黑色素瘤抗原-A1(MAGE-A1)特异性T细胞免疫水平与患者临床特征的关系,为临床免疫治疗潜在靶点的选择提供实验依据。方法收集2018-02-01-2019-04-30新疆医科大学附属肿瘤医院放疗中心收治的宫颈癌初治患者34例作为宫颈癌组,收集2018-01-01-2019-03-31健康志愿者14名作为健康对照组。用合成的MAGE-A1特异性抗原多肽刺激患者外周血单核细胞(PBMC)产生抗原特异性T细胞系,采用细胞内细胞因子染色法(ICS)检测宫颈癌患者T细胞亚群内γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素2(IL-2)、IL-13和巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)5种细胞因子的分泌,分析其与宫颈癌患者临床特征的关系。结果宫颈癌患者CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞对MAGE-A1抗原多肽产生免疫应答阳性率分别为23.5%(8/34)和20.6%(7/34)。宫颈癌组与健康对照组间MAGE-A1特异性CD4^(+)T细胞分泌单个细胞内细胞因子水平差异均无统计学意义,H_(IFN-γ)=0.000,H_(IL-2)=-0.368,H_(IL-13)=0.394,H_(MIP-1β)=-0.368,H_(TNF-α)=-0.183,均P>0.05。宫颈癌组MAGE-A1特异性CD8^(+)T细胞分泌IFN-γ的应答阳性率为52.9%(18/34),健康对照组为21.4%(3/14),H=-1.979,P=0.048。宫颈癌组CD4^(+)T细胞亚群中分泌IFN-γ+IL-2的细胞比例为2.09%(0.87%~4.33%),健康对照组为0.61%(0.24%~1.15%),Z=-3.031,P=0.002。MAGE-A1特异性CD4^(+)和CD8^(+)T细胞应答频率在各临床特征分组中差异均无统计学意义,均P>0.05。结论宫颈癌患者外周血T细胞能对MAGE-A1抗原多肽产生特异性的免疫应答,MAGE-A1特异性CD4^(+)、CD8^(+)T细胞应答频率在各临床特征分组中差异无统计学意义。入组样本有限,结论尚待进一步扩大样本量验证。

过敏原特异性T细胞检测方法的研究进展

追踪T细胞数量和功能的变化在临床诊断和评估过敏原免疫治疗疗效等方面具有重要的参考价值。本文综述了羧基荧光素琥珀碱亚胺酯连续稀释法、酶联免疫斑点检测法、胞内细胞因子染色法和微阵列免疫传感器等过敏原特异性T细胞检测方法和临床应用的研究进展,为选择和发展合适的检测方法并应用于临床提供参考。