初级纤毛/鞭毛转运系统介导力学反应性信号通路促骨髓基质干细胞成骨分化

背景:目前已证实力学刺激可以促进骨髓基质干细胞成骨分化,但其机制未完全明了。初级纤毛是重要的力学感受器并调控TGF-β1/BMP-2/SMAD等多种信号通路,很可能是骨髓基质干细胞力学调控的重要靶点。目的:探讨流体剪切力对骨髓基质干细胞成骨分化的影响及机制。方法:将大鼠骨髓基质干细胞分为对照组、力学刺激组(通过摇床施加流体剪切力学干预)、力学刺激+IFT88沉默组(力学刺激+使用siRNA沉默IFT88表达),干预24 h后,采用qRT-PCR检测转化生长因子β1、骨形成蛋白2的表达、Western blot检测磷酸化SMAD2/3蛋白的表达,初级纤毛免疫荧光染色及形态学分析。结果与结论:剪切力刺激可促进骨髓基质干细胞的初级纤毛表达,转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录激活,提高磷酸化SMAD2/3蛋白表达。siRNA干扰初级纤毛生成后,这一力学反应效应明显减低。骨髓基质干细胞的初级纤毛面积改变比值与转化生长因子β1及骨形成蛋白2基因转录增高比例具有Spearman相关性。结果表明:初级纤毛/鞭毛转运系统介导了流体剪切力反应性的TGF-β1/BMP-2/SMAD信号通路激活,促进骨髓基质干细胞成骨分化。

杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白88在鞭毛组装过程中的功能分析及其原核表达

目的:克隆杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白(IFT)88的cDNA全长并分析其部分功能。方法:根据盐藻转录组测序片段,分别设计其3'端内、外侧引物及5'端内、外侧引物,PCR扩增其全长。提取盐藻再生过程中不同时间段的总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR,检测IFT88 mRNA的表达情况。随后利用ORF finder预测并扩增其开放阅读框,连接到pET28a载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在1mmol/LIPTG、37℃的条件下诱导4h,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测IFT88蛋白表达情况。结果:克隆拼接后共得到开放阅读框2400bp,编码799个氨基酸。BLAST显示该氨基酸序列与多个物种的IFT88有较高同源性。SDS-PAGE结果显示,与未诱导组相比,诱导组在90000左右有一条明显的条带。在鞭毛再生过程中,杜氏盐藻IFT88 mRNA的表达量在去鞭毛后30min左右时最高,随后快速下降。结论:扩增得到杜氏盐藻IFT88 cDNA序列且IFT88可能参与盐藻鞭毛组装。

初级纤毛的研究进展

初级纤毛是近年来生物医学领域的一个研究热点。它存在于各种细胞表面,体形微小,结构复杂,具有重要的感官作用,可感知细胞外机械和化学信号变化,并协助其转导至细胞内部引发相应细胞应答。它自身组装、维持和分解所需的蛋白质,需要一组纤毛内转运蛋白来完成,即纤毛内转运系统(intraflagellar transport,IFT)。近年研究表明,初级纤毛与多种先天性疾病密切相关。随着免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察等新实验方法的应用,人们对初级纤毛及IFT系统有了更深入的了解,为进一步指导纤毛相关疾病的干预诊疗奠定了基础。

纤毛转运蛋白140谱系示踪小鼠模型构建

目的:研究纤毛转运蛋白140(intraflagellar transport protein 140,IFT140)阳性细胞在小鼠生长发育过程中的动态分布与转归。方法:利用Cre/loxP系统构建IFT140谱系示踪小鼠动物模型,将构建的IFT140-CreER小鼠与R26RtdTomato小鼠进行交配繁殖,获得基因型为IFT140-CreER;R26RtdTomato小鼠。用他莫昔芬(tamoxifen)腹腔注射诱导Cre重组酶表达,并在特定的时间点观察IFT140阳性细胞的分布、分化及转归规律。结果:聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)验证小鼠基因型符合IFT140-CreER;R26RtdTomato。结果显示,阳性细胞在纤毛富集的组织中信号清晰,模型构建成功;骨组织中的IFT140阳性细胞首先出现在骨髓中,随着骨骼发育分布于骨小梁及骨皮质表面。结论:本研究成功构建了谱系示踪小鼠模型,为观察IFT140在小鼠体内重要器官尤其是骨组织发育中的作用,提供实验动物模型。

正畸骨改建中Hedgehog通路下游信号的表达变化

目的Hedgehog信号通路在骨发育中有重要作用,本研究探讨Hedgehog通路下游信号在正畸骨改建中的表达变化。方法建立小鼠上颌正畸模型,在加力后0、7、14 d进行观察。Micro CT测量牙齿移动距离;HE染色和TRAP染色观察正畸骨改建和破骨细胞生成状况;免疫荧光染色观察骨改建中Gli1阳性细胞表达变化;实时荧光定量PCR检测Hedgehog信号通路分子表达水平及纤毛相关转运蛋白表达变化。结果正畸加力牙移动距离随时间逐渐增加;HE染色和TRAP染色示加力后牙槽骨改建明显且破骨细胞生成活跃;免疫荧光染色示Gli1阳性细胞在牙槽骨压力侧聚集表达,在加力第7天达到峰值(P<0.05);Hedgehog通路下游信号关键分子Shh,Smo,Gli1表达水平高于正畸前(P<0.05);各时间点纤毛相关转运蛋白表达水平变化有统计学意义(P<0.05)。结论Hedgehog信号通路下游分子和纤毛相关转运蛋白参与正畸骨改建过程。

纤毛转运蛋白对骨发育影响的研究进展

初级纤毛是突出于细胞表面的一种特殊细胞器,具有感受外界机械刺激和生物化学信号的功能。初级纤毛以微管为基础结构,外包被纤毛膜,内侧通过过渡区与细胞质相连接。纤毛内运输指纤毛转运蛋白在纤毛内携带信号分子进行的正向或逆向运输,是维持纤毛结构稳定和细胞信号传递的重要组成部分。纤毛转运蛋白的结构或功能改变,会导致人体多器官病变及功能紊乱。本文对纤毛转运蛋白的种类及其异常导致的硬组织相关疾病研究进展作一综述。

纤毛内转运蛋白20的研究进展

纤毛内转运蛋白20(intraflagellar transport protein 20,IFT20)是细胞纤毛内转运蛋白B类中的一种,定位于高尔基体,在纤毛内蛋白转运、纤毛组装和维持纤毛正常形态等多种生理功能的调节中具有关键性作用。IFT20的异常表达与肿瘤、多囊肾、免疫紊乱等多种疾病的发生有关,可能是一些重大疾病防治的分子靶点。

IFT20蛋白在肺癌组织中的表达及其对肺癌A549细胞增殖的影响

目的 :探讨纤毛内运输(intral agellar transport,IFT)蛋白20在肺癌组织中的表达及IFT20对肺癌A549细胞增殖的影响。方法 :免疫组织化学法检测20例肺癌组织和4例正常肺组织中IFT20蛋白的表达。将靶向IFT20基因的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)片段转染肺癌A549细胞后,实时荧光定量PCR法检测细胞中IF T20 m RNA的表达,MTT法检测细胞的增殖情况,免疫荧光染色法检测A549细胞中IFT20蛋白的表达情况以及纤毛的数量和长度,蛋白芯片检测A549细胞中蛋白的表达情况。结果 :IFT20蛋白在肺癌组织中呈弱阳性表达,而在正常肺组织中呈中度阳性表达。IFT20 si RNA成功转染后,A549细胞中IFT20 m RNA表达水平低于阴性对照组(转染control si RNA)和空白对照组(未转染的A549细胞)(P<0.05),细胞增殖加快(P<0.05);IF T20 si RNA转染组A549细胞IFT20蛋白表达水平下调,纤毛数量减少、长度变短或消失(P值均<0.05);IFT20 si RNA转染组A549细胞中X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、survivin、高温需求因子A(high temperature requirment A,HTRA)蛋白、热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)27、Hsp70和SMAC(second mitochondria-derived activator of caspases)的表达水平上调(P值均<0.05)。结论 :在肺癌组织中存在IFT20蛋白的低表达,抑制IFT20可以使肺癌A549细胞的纤毛数量减少和纤毛长度变短或消失,并促进肺癌细胞的增殖。