沙门氏菌的invA基因序列分析与分子检测

目的采用聚合酶链反应和DNA序列分析,了解沙门氏菌侵袭蛋白A(invasionproteinA,invA)基因核苷酸序列有何差异,建立沙门氏菌的分子快速检测方法。方法根据沙门氏菌的invA基因核苷酸序列设计一对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株的invA基因及6种非沙门氏菌株进行PCR扩增,并将扩增的片段进行克隆及序列分析。结果3种沙门氏菌标准菌株PCR均扩增出283bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增;DNA序列分析证实,沙门氏菌的invA基因核苷酸序列比较保守。结论本研究建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,invA基因的序列分析为进一步研究沙门氏菌不同分离株的流行病学、遗传学与分子致病机理奠定了基础。

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL。本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础。

沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用

目的:建立适合基层检验部门使用的快速检测沙门菌LAMP法。方法:在65℃普通恒温水浴中、60 min扩增沙门菌invA基因片段,目测或电泳快速检测沙门菌。分别对环介导等温扩增(LAMP)反应影响较大的温度、Betaine浓度等进行优化,并对实验室保存的28种沙门菌不同血清型共34株和其他9种肠杆菌科细菌进行检测;对部分沙门菌进行污染血清直接LAMP模拟检测。结果:28种不同血清型的沙门菌LAMP检测都呈阳性,其它9种肠杆菌科细菌均为阴性;血清模拟实验与菌株直接DNA提取LAMP检测结果一致。结论:LAMP法能够快速、特异地检测沙门菌,且不需要昂贵的仪器,适合基层检验部门使用。

沙门氏菌invA基因重组质粒标准的构建

目的研制沙门氏菌invA基因重组质粒,为分子生物学方法快速检测沙门氏菌提供质粒标准。方法通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,测序方法证实目的片段已成功重组,荧光定量PCR方法定性检测分析,采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法对标准质粒分子进行定值。结果 invA基因目的片段成功重组至pMD 18-T载体上,荧光定量PCR结果显示制备重组质粒标准为沙门氏菌核酸标准,重组质粒标准的浓度为2.9μg/mL。结论成功构建沙门氏菌invA基因重组质粒,为快速检测沙门氏菌奠定了基础。

分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5'端标记6-fluorescine(6-FAM),3'端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL),对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袭型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104.5、85.9、83.1、94.8、46.1,Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121.3、64.2、45.6、42.8、54.5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21,结果阳性,与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。

环丙沙星对沙门菌毒力岛基因invA影响的分析

目的:分析沙门菌毒力岛基因invA在不同血清型的基因变异和耐环丙沙星菌株中基因突变情况,及环丙沙星对沙门菌生长能力的影响。方法:用微量肉汤稀释法测定6个血清型的40株沙门菌的环丙沙星MIC;采用多阶段筛选法对敏感菌株诱导环丙沙星耐药株;对invA基因进行测序比对,分析其基因变异和突变情况;测定诱导前后沙门菌的生长曲线。结果:不同血清型的沙门菌其invA基因序列存在不同程度的变异,但均属于沉默突变;环丙沙星耐药株未发现invA基因突变或缺失;环丙沙星诱导后沙门菌的生长能力明显减弱(P<0.001)。结论:invA基因在不同血清型的变异,说明沙门菌的毒力仍在进化中;环丙沙星未引起invA基因的突变或缺失,但可使沙门菌的生长能力下降。

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。

喹诺酮对沙门菌毒力基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响

目的:研究喹诺酮对沙门菌毒力岛基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响。方法:用多阶段诱导方式体外筛选耐喹诺酮沙门菌株,用荧光定量PCR方法测定喹诺酮敏感株和耐药株的hilA和invA基因的mRNA表达水平。结果:与喹诺酮敏感株相比,喹诺酮耐药株的hilA和invA的mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)。结论:喹诺酮可导致沙门菌毒力相关基因表达水平降低,这意味着喹诺酮耐药株毒力和致病性的降低。

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGK INVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础。方法将invA基因克隆于pGK b le24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGK INVA。质粒pGK INVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株。结果从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGK b le24构建重组穿梭质粒pGK INVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在K orthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株。结论成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGK INVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析。

鸡白痢沙门氏菌分离株invA基因的克隆与序列分析

为了克隆新疆分离株invA基因,并更进-步探讨该基因的结构与功能.本试验以鸡白痢沙门氏菌新疆分离株为模板,通过PCR方法对invA基因进行克隆,并对其进行生物信息学分析.结果表明,PCR方法成功扩增出invA基因大小为1251bp的特异性目的条带,共编码417个氨基酸;该基因与鸡白痢沙门氏菌标准株的invA基因的核苷酸序列的同源性为99.8%,与其他物种invA基因的核苷酸序列的同源性为24.9%-54.0%;鸡白痢沙门氏菌新疆株invA基因所推导的氨基酸序列与参考株的同源性为99.77,与其他物种的invA基因所编码的氨基酸序列的同源性为22.0%-70.7%;该分离株invA蛋白预测的二级结构和三级结构以a-螺旋和折叠为主,为非分泌蛋白;从遗传进化树上可知,该鸡白痢沙门氏菌分离株invA基因的核苷酸序列与标准株在同一个进化分支上,与其他物种的invA基因的亲缘关系较远.该研究为新疆鸡白痢沙门氏菌的流行规律、遗传变异特征以及诊断试纸条的研究提供了依据.

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增ｉｎｖＡ基因检测沙门氏菌的ＰＣＲ方法，对收集的５０个血清型１２３株沙门氏菌及７种２７株非沙门菌进行ＰＣＲ，２％琼脂糖电泳检查，结果所有沙门氏菌都扩增出了３００ｂｐ的特异性产物，非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特性由ｓｌｏｔｂｌｏｔ杂交进一步证实。通过电泳判定结果，该法可检出扩增体系中１０ｐｇ染色体ＤＮＡ及１０＾２ｃｆｕ的纽波特沙门氏菌５００２９。

问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究

目的确定我国不同基因种问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株携带毒力相关基因invA的情况，了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化。方法采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体PatocI株invA基因。克隆问号钩体全长irwA基因并测序，构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统。Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rInvA后免疫家兔获得抗血清，免疫双扩散法检测其效价。建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型，采用荧光定量RT—PCR和Westernblot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化。结果4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因，双曲钩体PatocI株则否。4株不同基因种的问号钩体irwA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．33％～100％和98．66％～100％。所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA。rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1：16。问号钩体赖株感染HEK293细胞30min以后可大量黏附于细胞表面。问号钩体赖株感染HEK293细胞30min时，invA基因mRNA水平明显上调，45min时达到峰值，然后逐渐下降。问号钩体赖株感染HEK293细胞后45min和60min时可检出InvA蛋白，感染前及感染90min以后检测结果均为阴性。结论invA基因是致病性问号钩体所特有的基因。invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点，与问号钩体侵人宿主细胞密切相关。

福建省沙门菌病invA与spvB基因分布状况的研究

[目的]了解福建省沙门菌临床分离株invA与spvB基因的分布特点,为掌握我省沙门菌病分子流行病学特征提供依据。[方法]采集2006、2007年沙门菌临床分离株137株,煮沸裂解法提取DNA后对invA和spvB基因进行PCR检测。[结果]invA和spvB基因的阳性率分别为99.3%和24.8%;spvB基因在腹泻病例中的阳性率高于在发热病例中的阳性率,在非伤寒病例株的阳性率显著高于伤寒、副伤寒病例株的阳性率。[结论]invA基因可作为沙门菌病快速诊断基因,spvB基因在非伤寒、伤寒及副伤寒沙门菌血清型中均有不同程度地存在。

禽源沙门氏菌荧光定量PCR方法的构建及应用

试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。

黄芪皂苷Ⅱ对肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭能力的抑制作用及其机制

目的 探讨黄芪皂苷Ⅱ(ASⅡ)对肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭的抑制作用,并分析该作用与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法 取人肾透明细胞癌细胞786-O,随机分为对照组、ASⅡ组和LiCl干预组。对照组仅更换新鲜血清培养基,不进行其他处理;ASⅡ组加入100μmol/L ASⅡ溶液;LiCl干预组先加入10 mmol/L LiCl(Wnt/β-catenin信号通路激活剂)溶液,24 h后加入100μmol/L ASⅡ溶液。采用细胞划痕实验观察各组细胞迁移能力,Transwell实验观察细胞侵袭能力,Western blotting法检测细胞上皮间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)。结果 与对照组比较,ASⅡ组细胞迁移率降低;与ASⅡ组比较,LiCl干预组细胞迁移率升高(P均<0.01)。与对照组比较,ASⅡ组穿膜细胞数减少;与ASⅡ组比较,LiCl干预组穿膜细胞数增加(P均<0.01)。与对照组比较,ASⅡ组E-cadherin蛋白表达水平升高,N-cadherin、Vimentin及β-catenin蛋白表达水平降低;与ASⅡ组比较,LiCl干预组E-cadherin蛋白表达水平降低,N-cadherin、Vimentin及β-catenin蛋白表达水平升高(P均<0.01)。结论 ASⅡ能够抑制肾透明细胞癌细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路来抑制细胞EMT实现的。

LncRNAs-MEG3对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:研究长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNAs-MEG3)对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能机制。方法:体外培养鼻咽癌细胞系TW03、CNE-2,转染MEG3后分为空白对照组(NC)、阴性转染组(阴性对照质粒转染)和实验组(MEG3 mimis质粒转染)。采用实时定量PCR检测鼻咽癌细胞中LncRNAs-MEG3含量,CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与正常鼻咽上皮细胞系NP69相比,鼻咽癌细胞中MEG3的表达明显降低(0.62±0.04)(P<0.05)。与空白对照组、阴性转染组相比,实验组中MEG3 mRNA的表达升高(5.31±0.12)(F=441.062,P<0.01),同时检测到鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭均减少(F=10.832,P<0.05;F=1 534.134,P<0.05;F=1 430.212,P<0.05),凋亡增多(F=798.066,P<0.05),差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:MEG3在鼻咽癌中的表达降低,提高MEG3表达则能够抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,并促进细胞的凋亡,机制可能与抑制上皮-间质转化有关。

赖型钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA的表达及其促细胞增殖效应

目的 在大肠杆菌中表达赖型钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA ,并观察该蛋白对ANA 1细胞的增殖作用。方法 将invA基因克隆于pET32a(+)载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达带组氨酸标签的Trx InvA融合蛋白 ,经亲和层析获得纯化Trx InvA蛋白。以不同浓度的Trx InvA融合蛋白作用于ANA 1细胞 ,以四氮唑复合物 [2 ,3 bis(2 methoxy 4 nitro sulfophenyl) 5 〔(Phenylamino)carbonyl〕 2H tetrazoiumhydrixide,XTT]法检测细胞增殖的变化 ,分析InvA蛋白的细胞功能。结果 成功构建pETIN VA原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达了相对分子质量 (Mr)约为 35× 10 3的Trx InvA融合蛋白 ,该蛋白能促进ANA 1细胞的增殖。结论 表达并纯化的Trx

InvA-PCR应用于磐安县钩端螺旋体病检测的研究

目的:针对InvA-PCR方法检测钩端螺旋体病的研究。方法:根据侵袭蛋白A基因(InvA)与卫生行业标准推荐的引物G1/G2对比,进行特异性与灵敏度研究,并应用于磐安鼠标本钩端螺旋体PCR检测。对磐安县2009分离菌株进行钩端螺旋体InvA-PCR和LS-PCR鉴定。结果:InvA-PCR具有较高的灵敏度和特异性,该引物可特异性扩增致病性钩端螺旋体DNA,对本实验所用的其他细菌不扩增。2009年分离的钩端螺旋体菌株进行PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符。对鼠标本进行InvA-PCR检测,InvA-PCR检测阳性率为5%。与卫生行业标准推荐的引物G1/G2对比,符合率为100%。结论:InvA-PCR检测方法可灵敏、特异地检测致病性钩端螺旋体,能正确有效地反应野生动物带毒率,为控制钩端螺旋体病提供依据。

InvA-PCR快速检测鼠肾标本中钩端螺旋体

目的:探讨InvA-PCR方法快速检测钩端螺旋体的应用价值。方法:对2009年淳安县106只鼠肾标本直接提取其DNA用invA-PCR法进行检测,同时对106只鼠肾标本进行分离培养和显微镜凝集试验(MAT)血清学鉴定。结果:106只鼠肾标本经InvA-PCR法检测,9份标本钩端螺旋体invA基因呈阳性,阳性率为8.5%。106只鼠肾标本分离培养,分离到3株钩端螺旋体菌株,均为黄疸出血群,阳性率为2.8%。3份培养阳性标本InvA-PCR均阳性。结论:InvA-PCR方法操作方便、耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为致病性钩端螺旋体可靠的快速诊断方法,可用于钩体病的流行病学调查和钩体病临床标本快速初筛。

平乐郭氏正骨手法配合钢针撬拨复位治疗MasonⅡ型桡骨头骨折临床观察

目的:观察平乐郭氏正骨手法配合钢针撬拨复位治疗型桡骨头骨折的临床疗效。方法:选择MasonⅡ型桡骨头骨折患者68例,分为观察组37例和对照组31例,在常规术前冷疗、术后石膏固定等治疗基础上,对照组取切开复位微T形钛板内固定术,观察组采用平乐郭氏正骨手法配合钢针撬拨复位固定术。统计对比两组患者手术时间、术中出血量、住院时间、疼痛评分、肘关节功能Broberg-Morrey评分,并评价两种治疗方法安全性。所有患者随访1年。结果:经治疗,两组患者的疼痛评分均较治疗前降低,Broberg-Morrey评分均升高(P<0.05)。组间比较,观察组的手术时间、住院时间均较对照组短,术中出血量少于对照组,术后各个时间点的疼痛评分均低于对照组,Broberg-Morrey评分均高于对照组(均P<0.05)。在安全性方面,两组患者均未发生术后感染、神经损伤等严重并发症,观察组患者术后内固定物克氏针失效2例,对照组延迟愈合1例、骨化性肌炎1例,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:平乐郭氏正骨手法配合钢针撬拨复位固定治疗MasonⅡ型桡骨头骨折能获得良好的功能复位,达到骨折临床愈合,减少手术创伤,尽快恢复肘关节功能。