沙门氏菌的invA基因序列分析与分子检测

目的采用聚合酶链反应和DNA序列分析,了解沙门氏菌侵袭蛋白A(invasionproteinA,invA)基因核苷酸序列有何差异,建立沙门氏菌的分子快速检测方法。方法根据沙门氏菌的invA基因核苷酸序列设计一对引物,应用聚合酶链反应技术,分别对3种沙门氏菌标准菌株的invA基因及6种非沙门氏菌株进行PCR扩增,并将扩增的片段进行克隆及序列分析。结果3种沙门氏菌标准菌株PCR均扩增出283bp的特异条带,非沙门氏菌皆无特异带扩增;DNA序列分析证实,沙门氏菌的invA基因核苷酸序列比较保守。结论本研究建立的检测沙门氏菌方法具有较高的特异性与灵敏性,invA基因的序列分析为进一步研究沙门氏菌不同分离株的流行病学、遗传学与分子致病机理奠定了基础。

肉制品中沙门氏菌invA基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对沙门氏菌invA基因设计一对特异引物,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性检测。结果表明,所建立的沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法,特异性良好,组间组内重复性良好,沙门氏菌检测下线为101CFU/mL。本研究建立了沙门氏菌特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR检测方法,为沙门氏菌的快速诊断奠定了基础。

沙门菌invA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用

目的:建立适合基层检验部门使用的快速检测沙门菌LAMP法。方法:在65℃普通恒温水浴中、60 min扩增沙门菌invA基因片段,目测或电泳快速检测沙门菌。分别对环介导等温扩增(LAMP)反应影响较大的温度、Betaine浓度等进行优化,并对实验室保存的28种沙门菌不同血清型共34株和其他9种肠杆菌科细菌进行检测;对部分沙门菌进行污染血清直接LAMP模拟检测。结果:28种不同血清型的沙门菌LAMP检测都呈阳性,其它9种肠杆菌科细菌均为阴性;血清模拟实验与菌株直接DNA提取LAMP检测结果一致。结论:LAMP法能够快速、特异地检测沙门菌,且不需要昂贵的仪器,适合基层检验部门使用。

沙门氏菌invA基因重组质粒标准的构建

目的研制沙门氏菌invA基因重组质粒,为分子生物学方法快速检测沙门氏菌提供质粒标准。方法通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,测序方法证实目的片段已成功重组,荧光定量PCR方法定性检测分析,采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法对标准质粒分子进行定值。结果 invA基因目的片段成功重组至pMD 18-T载体上,荧光定量PCR结果显示制备重组质粒标准为沙门氏菌核酸标准,重组质粒标准的浓度为2.9μg/mL。结论成功构建沙门氏菌invA基因重组质粒,为快速检测沙门氏菌奠定了基础。

分子信标探针技术检测沙门菌invA基因

目的研究沙门菌的分子信标基因检测方法。方法在PCR反应体系中加入分子信标探针,探针的5'端标记6-fluorescine(6-FAM),3'端标记4-(dimethylaminophenylazo)benzoic acid (DABCYL),对沙门菌invA基因PCR产物进行荧光检测。结果肠炎沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、伤寒沙门菌“H”、伤寒沙门菌和肠侵袭型大肠杆菌的荧光值分别为161.6、104.5、85.9、83.1、94.8、46.1,Ax值(样本荧光值-空白对照荧光值)分别为121.3、64.2、45.6、42.8、54.5、5.8,沙门菌的Ax值均大于21,结果阳性,与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标探针技术可以准确、快速、简便进行沙门菌invA基因检测。

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。

鸡白痢沙门氏菌分离株invA基因的克隆与序列分析

为了克隆新疆分离株invA基因,并更进-步探讨该基因的结构与功能.本试验以鸡白痢沙门氏菌新疆分离株为模板,通过PCR方法对invA基因进行克隆,并对其进行生物信息学分析.结果表明,PCR方法成功扩增出invA基因大小为1251bp的特异性目的条带,共编码417个氨基酸;该基因与鸡白痢沙门氏菌标准株的invA基因的核苷酸序列的同源性为99.8%,与其他物种invA基因的核苷酸序列的同源性为24.9%-54.0%;鸡白痢沙门氏菌新疆株invA基因所推导的氨基酸序列与参考株的同源性为99.77,与其他物种的invA基因所编码的氨基酸序列的同源性为22.0%-70.7%;该分离株invA蛋白预测的二级结构和三级结构以a-螺旋和折叠为主,为非分泌蛋白;从遗传进化树上可知,该鸡白痢沙门氏菌分离株invA基因的核苷酸序列与标准株在同一个进化分支上,与其他物种的invA基因的亲缘关系较远.该研究为新疆鸡白痢沙门氏菌的流行规律、遗传变异特征以及诊断试纸条的研究提供了依据.

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增ｉｎｖＡ基因检测沙门氏菌的ＰＣＲ方法，对收集的５０个血清型１２３株沙门氏菌及７种２７株非沙门菌进行ＰＣＲ，２％琼脂糖电泳检查，结果所有沙门氏菌都扩增出了３００ｂｐ的特异性产物，非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特性由ｓｌｏｔｂｌｏｔ杂交进一步证实。通过电泳判定结果，该法可检出扩增体系中１０ｐｇ染色体ＤＮＡ及１０＾２ｃｆｕ的纽波特沙门氏菌５００２９。

环丙沙星对沙门菌毒力岛基因invA影响的分析

目的:分析沙门菌毒力岛基因invA在不同血清型的基因变异和耐环丙沙星菌株中基因突变情况,及环丙沙星对沙门菌生长能力的影响。方法:用微量肉汤稀释法测定6个血清型的40株沙门菌的环丙沙星MIC;采用多阶段筛选法对敏感菌株诱导环丙沙星耐药株;对invA基因进行测序比对,分析其基因变异和突变情况;测定诱导前后沙门菌的生长曲线。结果:不同血清型的沙门菌其invA基因序列存在不同程度的变异,但均属于沉默突变;环丙沙星耐药株未发现invA基因突变或缺失;环丙沙星诱导后沙门菌的生长能力明显减弱(P<0.001)。结论:invA基因在不同血清型的变异,说明沙门菌的毒力仍在进化中;环丙沙星未引起invA基因的突变或缺失,但可使沙门菌的生长能力下降。

喹诺酮对沙门菌毒力基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响

目的:研究喹诺酮对沙门菌毒力岛基因hilA和invA的mRNA表达水平的影响。方法:用多阶段诱导方式体外筛选耐喹诺酮沙门菌株,用荧光定量PCR方法测定喹诺酮敏感株和耐药株的hilA和invA基因的mRNA表达水平。结果:与喹诺酮敏感株相比,喹诺酮耐药株的hilA和invA的mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)。结论:喹诺酮可导致沙门菌毒力相关基因表达水平降低,这意味着喹诺酮耐药株毒力和致病性的降低。

市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的分离鉴定及毒力岛基因检测

目的:监测市售鲜鸡蛋中沙门氏菌的污染情况,检测分离菌株的致病性及其毒力岛基因携带情况,了解沙门氏菌分离株毒力岛基因的携带与其致病力的相关性。方法:从陕西省不同地市的超市中随机购买鲜鸡蛋,无菌取其蛋壳膜分离沙门氏菌,聚合酶链式反应方法扩增沙门氏菌菌属特异性invA基因鉴定分离株;对分离菌株进行无特定病原体(SPF)雏鸡的致病性试验,依据GenBank发表的基因序列,设计引物聚合酶链式反应检测沙门氏菌毒力岛(SPI)核心蛋白基因。结果:从陕西省55家超市1100枚鲜蛋中分离鉴定出30株沙门氏菌,分离率达2.73%;动物致病性实验表明,30株沙门氏菌中13株有致病力,其中强致病力菌株有7株,占23.3%;分离菌株的毒力岛基因携带率分别为:SPI-1 60%、SPI-2 73.3%、SPI-3 100%、SPI-4 90%、SPI-5 76.7%,毒力岛基因SPI-1+SPI-2的携带与细菌致病性有关。结论:市售鲜鸡蛋中沙门氏菌携带率为2.73%,分离菌株对动物具有一定的致病力,毒力岛基因SPI-1+SPI-2的携带与沙门氏菌的致病性呈正相关。

禽源沙门氏菌荧光定量PCR方法的构建及应用

试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。

大肠杆菌-钩端螺旋体重组穿梭质粒pGKINVA的构建及重组钩体的筛选

目的构建大肠杆菌-钩体穿梭质粒pGK INVA,并重组于钩体PatocⅠ株,为进一步确定钩体invA基因的功能奠定基础。方法将invA基因克隆于pGK b le24载体,PCR、限制性内切酶双酶切及测序鉴定重组穿梭质粒pGK INVA。质粒pGK INVA经电穿孔法转化无毒钩体PatocⅠ株,并筛选重组钩体菌株。结果从钩体基因组中克隆出长558 bp的invA基因,定向插入pGK b le24构建重组穿梭质粒pGK INVA,抗生素及蓝/白斑筛选和测序鉴定并获得正确的重组质粒后,电穿孔法转化钩体PatocⅠ株,在K orthof固体培养基生长并抗生素筛选、PCR鉴定出重组钩体菌株。结论成功构建重组大肠杆菌-钩端螺旋体穿梭质粒pGK INVA,并筛选出2个重组钩体菌株,将有助于进一步阐明invA基因在钩体体内中的功能分析。

实时荧光PCR检测沙门菌特异基因

目的:建立一种灵敏、快速检测沙门菌的实时荧光PCR方法。方法:针对沙门菌特异性基因invA设计引物、探针,在实时荧光PCR仪上进行扩增、检测和结果分析。结果:应用该实时荧光PCR方法,30株沙门菌检测结果均为阳性,19株非沙门菌结果均为阴性,96个肛门拭子样本增菌前后的PCR结果一致;检测灵敏度达到4 cfu/test,定量结果与培养计数无显著差异。结论:该方法检测沙门菌具有灵敏度高、快速方便的特点,且可用于定量检测。

中成药中沙门氏菌环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

目的建立以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法选择沙门氏菌的毒力因子invA基因作为检测模板,采用Primer Exploer V5软件设计3组LAMP引物[正向外引物(F3)、反向外引物(B3),正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP),正向环引物(LF)、反向环引物(LB)],以4种沙门氏菌(甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)和3种非沙门氏菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产志贺氏毒素大肠埃希氏菌)的细菌DNA为模板,进行LAMP快速检测。结果在反应温度为65℃、反应时间为60 min条件下,即可快速检测4个亚种沙门氏菌,其检测灵敏度可达10 cfu/mL,且试验结果易于观察,筛选的引物特异性良好。结论所建立的方法灵敏度高、特异性好、检测快速,可应用于中成药中沙门氏菌的快速检测。

沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用

建立一种重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification,RPA)检测沙门氏菌(Salmonella)的方法。本研究依据沙门氏菌侵袭蛋白A基因(invA)的保守序列设计特异性引物,通过对反应时间的优化,建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20 min,即可实现对目的片段的有效扩增;除沙门氏菌外,其他26 种食源性致病菌均无扩增,具有良好的特异性;以沙门氏菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.1×10^(-3) ng/μL,与本研究应用的实时荧光聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,PCR)方法一致;人工污染实验表明,当羊肉、鸡肉和西兰花样品污染量为4 CFU/25 g,增菌8 h,即可通过RPA方法检出沙门氏菌。在人工污染实验中,RPA和PCR检测结果一致。本研究建立的沙门氏菌的RPA检测方法特异性强、操作简单、为食源性致病菌的鉴定提供了一种新的方向。

2011至2012年石家庄地区沙门菌食物中毒分离株分子流行病学特征

研究沙门菌食物中毒分离株invA基因、血清型和基因型的分子流行病学特征。收集2011至2012年发生于石家庄地区6起食物中毒分离出的16株沙门菌,参照GB 4789.4-2010方法确定其血清型;用实时荧光PCR法检测分离株侵袭蛋白A(invA)基因;应用中国细菌性传染病分子分型实验室监测网络(PulseNet China)推荐的脉冲场凝胶电泳技术对分离株进行基因型研究。16株沙门菌食物中毒分离株共分为5种血清型,分别为都柏林沙门菌2株、鼠伤寒沙门菌2株、肠炎沙门菌8株、圣保罗沙门菌3株、依麦克沙门菌1株;所有分离株invA基因均为阳性;血清型不同的分离株基因型也不相同,其中2起食物中毒分离株的基因型相同,相似性系数为100%,符合同一起暴发的一般规律。石家庄地区沙门菌食物中毒分离株致病性较强,某些血清型存在暴发的风险,应加强措施进行防范。

沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。

12小时PCR技术快速检测沙门菌

[目的]本课题根据致痫性沙门菌的invA基因序列设计引物,进行PCR反应,扩增出389bp的特异性片断,从而检测出目标菌。[方法]将试验菌种BPV中非选择性增菌6h:45min沸水浴破细胞,释放染色体DNA制作模板:PCR扩增约3h（1:95℃5min预变性:2:95℃1.5min变性3:62℃lmin退火:4:72℃ 45S延伸:5:72℃7min延长其中4至2步循环35次）。[结果]所得扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳约1h,紫外灯下可见扩增条带。[结论]通过调节Mg2+浓度,引物浓度和模板量和纯化方法,优化反应条件,初步建立了一种12h内快速检测沙门菌的方法,灵敏度可达40-50cfu/ml。

鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、高效和简便的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法,根据沙门菌侵袭蛋白基因invA的高度保守区域,利用Primmer 5.0软件设计2对特异性的套式引物,以提取的沙门菌DNA为模板克隆invA基因,将其连入T载体并计算拷贝数作为套式PCR的模板,在对反应条件进行优化的基础上,建立最佳的套式PCR反应条件,确定其上、下游引物用量分别为0.3μL,套式PCR的第1次退火温度为57.4℃,第2次为53.5℃。应用该方法对已构建好的不同浓度的标准阳性质粒作为模板进行检测,其灵敏度为102拷贝数/20μL,远高于常规PCR的106拷贝数/20μL。用建立的套式PCR方法对从新疆石河子某鸡场采集的25样品进行检测,与传统的诊断方法比较符合率达95.00%。建立的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法具有快速、可行、特异性强、准确率高等特点,为鸡沙门菌病的早期诊断和研究提供了技术支撑。