鸡鲍氏志贺菌ipaH基因的克隆与序列分析

利用PCR技术扩增鸡鲍氏志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH),并与GenBank数据库中不同菌株进行序列比对与同源性分析。结果显示,分别扩增出ipaH_1、ipaH_2、ipaH_3、ipaH_4、ipaH_5和ipaH_6等目的基因。核苷酸序列比对和同源性分析结果显示,鸡鲍氏志贺菌6个ipaH基因片段均与美国鲍氏志贺菌CP001063的核苷酸序列同源性最高,其次是中国鲍氏志贺菌CP000036,提示鸡鲍氏志贺菌可能起源于人鲍氏志贺菌。

PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial

目的:建立一种快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法对腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH及ial进行检测.方法:分别应用常规培养生化血清学鉴定方法、普通PCR、巢氏PCR(nested-PCR)方法,对71例腹泻患者粪标本进行检测.痢疾杆菌致病基因ipaH及ial的扩增产物经电泳分离.结果:在71例腹泻患者粪标本中,常规培养生化血清学鉴定方法分离出福氏痢疾杆菌24例,宋内痢疾杆菌23例,志贺痢疾杆菌1例,沙门菌23例.采用普通PCR法检测痢疾杆菌粪标本48例,ipaH基因均阳性(100%);ial基因阳性34例(70.8%),余14例为阴性.对该14例粪标本进而采用巢氏PCR法进行ial基因扩增,其中12份标本阳性.48例痢疾杆菌粪标本中46例ipaH和ial基因为双阳性(46/48).沙门菌粪标本23例中ipaH及ial基因表达均为阴性.以上两种方法的诊断一致性检验Kappa=0.937,差异有统计学意义(P<0.05).71例腹泻患者粪标本采用PCR和巢氏PCR法扩增得到的ipaH和ial基因特异片段与基因库中发表的标准菌株序列比较,一致性为100%.结论:建立了快速诊断腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial的PCR检测方法,具有简便、快速、特异和敏感的特点.

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。

福氏志贺菌4C亚型生物学特性研究及ipaH基因检测

目的:了解福氏志贺菌4C亚型(F4c)的生物学特性及毒力情况。方法:以生化反应、噬菌体裂解试验、血清分型鉴定菌种;按K-B法进行药敏试验;采用PCR技术检测ipaH基因;同时观察对动物的侵袭力。结果:该菌型具有志贺菌属的基本特点,靛基质等试验传代后有变化,能被Ent噬菌体溶原化而出现型抗原变异现象,ipaH基因和动物侵袭力试验阳性,对四环素、TMP等耐药。结论:F4c是一个少见的血清型,生物学特性与F2a相近,一定条件下能出现型抗原和生化特性变异。

实时荧光PCR检测志贺菌特异基因ipaH

目的:建立一种灵敏、快速检测志贺菌的实时荧光PCR方法,研究志贺菌在腹泻病人中的感染情况。方法:针对志贺菌特异性基因ipaH设计引物、探针,应用培养分离的志贺菌进行验证,同时检测360例临床标本并与培养法进行对照。结果:应用实时荧光PCR方法,10株志贺菌检测结果均为阳性,10株非志贺菌结果均为阴性;检测灵敏度达到4 cfu/test。360例临床标本中实时荧光PCR方法检测出29例阳性,培养法检测出12例阳性。结论:实时荧光PCR法检测志贺菌具有灵敏度高、快速方便的特点,可用于检测腹泻病人志贺菌感染。

志贺菌ipaH基因PCR检测方法的建立及应用

为了掌握青海省4种食源性动物体内志贺菌的分布情况,针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH)设计1对特异性引物,建立志贺菌的PCR检测方法,优化反应体系,检测该方法的敏感性和特异性,并将该方法应用于临床样本检测。结果表明,建立的PCR方法能特异性扩增志贺菌ipaH基因,而沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌等均未扩增出条带;最低检测限值为1.8 pg/μL。在临床样本检测中,100株疑似菌株的阳性率为62.00%,其中牦牛源75.00%(3/4),鸡源35.29%(12/34),羊源44.44%(8/18),猪源88.64%(39/44);新鲜鸡粪和羊粪的阳性率分别为91.67%(11/12)和90.91%(10/11)。这说明试验所建立的PCR方法具有良好的敏感性和特异性,可应用于志贺菌的实验室诊断;4种动物体内均不同程度带菌,在临床诊断和治疗时不可忽视该菌的致病作用。

基于ipaH基因的志贺菌LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种快速、特异、敏感的志贺菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法,试验针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH)设计一套特异性引物,条件优化及特异性和敏感性验证后建立了该菌的LAMP检测方法,并应用于临床样本的检测。结果显示,62℃恒温扩增1 h能得到明显的扩增产物,除志贺菌标准菌株扩增结果为阳性外,沙门菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和阴性对照均为阴性,检测限值达到120 fg/μL。利用建立的方法检测了20株疑似菌株和38份粪样样品,结果显示20株疑似菌和27份粪样样品为阳性,阳性率分别为100%和71.05%,说明建立的LAMP检测法具有良好的特异性和敏感性,在粪便等临床样本中志贺菌的检测与鉴定方面具有优势和应用前景。

用检测ipaH基因的PCR检测志贺菌属

目的建立一种检测志贺菌属快速敏感的PCR方法。方法根据志贺菌属侵袭性质粒抗原H(invasive p lasm id,ipaH)编码基因序列,设计1对PCR引物特异性扩增长度为204 bp的靶基因片段,通过检测3株志贺菌属菌株和6株非志贺菌属菌株来评价该方法的特异性;对福氏志贺菌菌液做一系列10倍稀释后进行PCR分析敏感性,PCR扩增产物经电泳和测序鉴定。结果3株志贺菌属菌株出现特定大小的目的条带,6株非志贺菌属菌株未出现目的条带;测序也证实了PCR产物的特异性;PCR检测福氏志贺菌ipaH基因的下限为10 CFU/m l。结论本研究建立的方法快速、特异、敏感。

对药物反应不佳的IPAH患者可采用肺动脉去神经术

《美国心脏病学会杂志》（JACC）7月电子版发表了一项关于特发性肺动脉高压（IPAH）治疗方案选择的研究，该研究指出对于药物治疗反应不佳的IPAH患者，可采用肺动脉去神经术（PAND）进行治疗。

以酵母菌双杂合技术寻找志贺氏菌IpaH7.8作用蛋白质的目标蛋白

背景:志贺氏菌感染能造成人类出血性腹泻,此菌常带有一大型毒性质体,以携带第三型分泌系统及相关致病基因,并透过此系统释放作用蛋白,协助菌体侵入人类肠壁细胞,操控细胞功能,以利在细胞中存活及增殖。IpaH家族蛋白是作用蛋白中较特别的一群,志贺氏菌常带有数个IpaH家族基因,除了在毒性质体上,经常同时存在染色体上。从蛋白质结构上来说,IpaH家族蛋白皆由两个功能性区域组成,其C端均为E3泛素连接酶,而N端在不同IpaH家族蛋白则具有不同的白氨酸重复序列,可能结合不同的目标蛋白,最后将其泛素化。其中IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH9.8在侵入宿主细胞后才释放;目前已有研究发现IpaH4.5和IpaH9.8的目标蛋白,其他IpaH蛋白的目标蛋白和功能则仍未知,因此我们希望利用酵母菌双杂合技术找出IpaH7.8的目标蛋白。方法:使用酵母菌双杂合系统筛选,接着将可能的候选蛋白,以其在细胞内的分布、伪阳性的可能性、与IpaH7.8交互作用的强度等,作进一步评估,最后以共同沉淀技术进行验证。结果:经酵母菌双杂合系统筛选后,我们得到6个候选蛋白,其中多数参与细胞的代谢反应。其中一候选蛋白-RAD50,主要分布在细胞核,而我们直接在细胞中表现IpaH7.8 N端和绿色萤光蛋白的融合蛋白,也发现绿色萤光聚集在细胞核,因此推测RAD50为候选蛋白的可能性最高。将IpaH7.8和RAD50进行共同沉淀,显示两者在生物体外的条件下可互相结合。

城市生活污水中志贺氏菌ipaH毒力基因的定量PCR检测

基于ipaH毒力基因的实时荧光定量PCR检测,建立适合城市污水中志贺氏菌的定量检测方法。使用从临床分离出的志贺氏菌构建重组质粒作为实时荧光定量PCR的标准品。在ipaH基因模板量2.58×100～2.58×106copy范围内具有良好的线性关系,每100 mL水样中含有2.58×101copy以上的ipaH基因即可被检出。从西安市生活污水分离得到2株野生型志贺氏菌,分析ipaH基因数量和菌体数量的关系,从而确定ipaH基因定量检测志贺氏菌的可行性。该方法灵敏、快速、特异性好,适用于城市生活污水中志贺氏菌的检测。

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。

福氏志贺菌Ⅲ型分泌系统效应子IpaH4．5功能的初步研究

目的:IpaH家族是福氏志贺菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应子的成员,但功能不清,特别是对IpaH4.5的研究未见报道。本研究拟探讨IpaH4.5的功能。方法:克隆了福氏志贺菌2a 301株的IpaH4.5基因,构建了带Flag和GFP标签的IpaH4.5真核表达载体。通过Western印迹和共聚焦确定IpaH4.5在真核细胞293T中的表达和定位,通过报道基因的方法观察IpaH4.5对宿主细胞NF-κB途径的影响。结果:Western印迹证实IpaH4.5在真核细胞中有表达,激光共聚焦确定IpaH4.5在真核细胞中定位于细胞膜和细胞核,通过报道基因观察到它可以抑制宿主细胞的NF-κB途径。结论:发现IpaH4.5可以抑制NF-κB途径,为进一步研究IpaH4.5的功能奠定了基础。

LAMP技术应用于志贺菌及侵袭性大肠埃希菌ipaH基因快速检测

目的:建立一种适合基层实验室快速检测志贺菌及侵袭性大肠埃希菌(EIEC)的实验方法。方法:根据志贺菌及EIEC共同含有的侵袭性质粒抗原ipaH基因序列设计4条引物,应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal am-plification)方法,分别对8株背景明确的不同血清型志贺菌标准株、34株志贺菌地方分离株、1株EIEC实验标准株、7株大肠埃希菌本室保存标准株、3株大肠埃希菌暴发株、10株其他肠道实验对照株进行检测,验证该方法的特异性及最低检测限,通过肉眼目测与电泳检测比较结果。结果:本方法中共计42株志贺菌、1株EIEC及1株44147大肠埃希菌,经用LAMP方法检测,均为绿色并电泳有相应阶梯状条带为阳性结果,而9株其他大肠埃希菌及10株其他肠道实验对照株均呈橙色并电泳无相应阶梯状条带为阴性结果。至于1株44147大肠埃希菌为何也检测出ipaH基因,我们怀疑该菌株要么是EIEC中的一种,要么是在长期进化过程中从别处获得该基因,这尚待今后做进一步探讨。本方法具有较好的特异性,其最低检测限为53 cfu/反应,自然光下通过肉眼即可判断结果,从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右。应用本方法对24份不同临床病人样本进行实际考核,3份痰液、1份胸积水、2份粪便及18份尿样经检测ipaH基因均为阴性,该结果与分离培养/普通PCR检测结果相符。结论:本次建立的LAMP方法,能快速、特异地检测志贺菌/EIEC,较适合基层实验室应用。

pMDl8-T-ipaH重组质粒的构建与鉴定

目的:构建并鉴定pMDl8-T-ipaH重组质粒载体,为探索采用二聚体蝎形探针荧光更精确的定量检测志贺菌标准品的方法奠定基础。方法:以志贺菌袭性相关位的ipaH基因为模板,采用PCR进行扩增,电泳回收纯化,经酶切后克隆入载体质粒pMDl8-T中,最终构建重组质粒pMDl8-T-ipaH,进行酶切和测序鉴定。结果:成功克隆出151 bp左右的ipaH基因片段,导入质粒后,经检酶切及测序鉴定质粒基因片段与目标基因序列一致。结论:成功的构建了pMDl8-T-ipaH重组质粒,为进一步检测志贺菌建立标准品奠定了前期基础。

三株异菌脲高效降解菌株的筛选、鉴定及其降解特性分析

为筛选适宜青藏高原地区的异菌脲高效降解菌株资源,采用富集培养法从西藏自治区蔬菜大棚土壤中分离得到Y-20、Y-29和Y-32三株异菌脲高效降解菌株,通过形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析对上述菌株进行初步鉴定,探讨NaCl浓度(m/V)、温度、pH值、接种量(V/V)和异菌脲初始浓度等因素对其异菌脲降解速率的影响,采用气相色谱法和PCR技术分析了上述菌株的异菌脲代谢途径及降解基因(ipaH)。结果表明,菌株Y-20、Y-29和Y-32为微杆菌属(Microbacterium)的3个不同种;在1.0%NaCl(m/V)、pH 7.0、25-30℃、5%的接种量(V/V)和100 mg/L初始异菌脲浓度的最佳条件下,上述菌株能够在8-12 h内完全降解100 mg/L的异菌脲;上述菌株能够将异菌脲降解为N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷和异丙基氨基甲酸,且含有高度相似的ipaH基因序列(99.14%-99.69%)。本研究为高原地区异菌脲污染环境的生物修复提供了菌株资源和理论依据。

PCR检测与细菌培养方法在细菌性痢疾监测中的应用比较

目的通过与PCR检测比较,确定细菌培养方法对细菌性痢疾疾病负担的低估程度。方法从2002年细菌性痢疾监测研究获得的10105份腹泻标本中随机选取337份,采用针对ipa H基因的PCR方法检测其志贺菌感染,并同传统细菌培养方法进行比较。结果337份腹泻标本中检测到ipa H基因212份,检出率为62.9%;而粪便培养阳性为39份,检出率为11.6%(P<0.001)。Logistic回归分析显示影响PCR检出的因素依次为细菌培养结果(OR=15.5;95%CI:2.0-119.0),具有发热症状(OR=2.8;95%CI:1.2-6.2),菌痢流行季节的腹泻(OR=2.4;95%CI:1.4-4.3)及女性病例(OR=1.8;95%CI:1.1-3.0)。结论与PCR检测相比,传统细菌培养方法使得菌痢的发病率在相当大的程度上被低估。

牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR检测技术研究

建立牛奶中快速检测志贺氏菌的有效方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,筛选合适的DNA模板制备方法,采用快速常规PCR和定量实时PCR结合,对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测,检测敏感度可达到2CFU/ml,检出时间小于20h。新建的PCR方法具有特异性好,灵敏度高等特点,适用于快速、准确检测牛奶中志贺氏菌的需要。