鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B的制备及其体外抗炎机制研究

目的:从射干中分离制备高纯度的鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B,并探究其体外抗炎活性及机制。方法:采用聚酰胺柱色谱-重结晶法相结合从射干中分离纯化制备鸢尾甲苷A及鸢尾甲苷B单体;采用改良的Ellman比色法测定鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B对乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性的影响;采用CCK-8法测定不同浓度的鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B对细胞活力的影响,确定给药范围;以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞为炎症模型,采用Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量,Elisa法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-β)和IL-6含量;Western blot法检测细胞环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)蛋白表达。结果:聚酰胺对鸢尾甲苷A及鸢尾甲苷B有良好的分离纯化效果,并通过重结晶得到鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B单体,经HPLC峰面积归一化法计算其纯度均>98%;鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B对AChE具有一定的抑制作用;鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B给药浓度在12.5~200μg·mL^(-1)范围内对RAW 264.7细胞无抑制作用;与LPS模型组比较,鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B均能抑制细胞中NO,TNF-α,IL-β,IL-6的释放(P<0.05),且呈剂量关系,并能上调胆碱能抗炎通路α7nAChR蛋白表达(P<0.05)及下调花生四烯酸通路中COX-2蛋白和NO通路中iNOS蛋白的表达(P<0.05)。结论:鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B具有一定的体外抗炎活性,其抗炎机制是通过调节胆碱能抗炎通路、花生四烯酸代谢通路及NO通路,减少巨噬细胞中NO,TNF-α,IL-β和IL-6等炎性介质的释放,实现多途径抗炎作用。

鸢尾甲苷B对氧糖剥夺/复氧损伤PC12细胞的神经保护作用

利用PC12细胞建立氧糖剥夺(OGD)体外脑卒中损伤模型,采用该模型对射干中鸢尾甲苷B抗脑卒中进行活性评价。评价指标包括:细胞形态学观察、细胞存活率检测、细胞内活性氧(ROS)含量检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放率测定、细胞内钙离子(Ca^(2+))浓度检测、细胞凋亡情况检测等。结果显示,射干中天然异黄酮鸢尾甲苷B能显著减轻氧糖剥夺/复氧(OGD/R)造成的PC12细胞损伤,降低细胞凋亡,提升细胞存活率,降低Ca^(2+)、LDH、ROS水平。结果表明,鸢尾甲苷B对Na_(2)S_(2)O_(4)损伤的PC12细胞有明显的保护作用,其机理可能与脑内神经元的保护作用相关。

青蛙七中异黄酮类成分质量控制研究

目的:依据对青蛙七主要成分的表征结果,建立青蛙七薄层色谱(TLC)定性鉴别方法及一测多评(QAMS)的含量测定方法。方法:首先,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(UPLC-Q TOF MS/MS)技术对青蛙七的主要成分进行表征,使用ACQUITY UPLC^(Ⓡ)BEH C_(18)(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,正离子模式下采集信息;其次,通过TLC建立定性鉴别方法;最后,建立QAMS方法,采用Agilent 5 TC-C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.05%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱,以鸢尾黄素为内参物,建立其与鸢尾苷及野鸢尾黄素的相对校正因子,并通过校正因子计算3个异黄酮类成分的含量。同时与外标法(ESM)进行比较,以验证QAMS法的准确性和可行性。结果:UPLC-Q TOF MS共表征出青蛙七中5个含量较高的异黄酮类成分(鸢尾苷、鸢尾甲苷B、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、鸢尾黄酮A)。建立了鸢尾苷、鸢尾甲苷B、鸢尾黄素、野鸢尾黄素4个成分的TLC鉴别法。在一定的浓度范围内,鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素3个成分线性关系良好(r﹥0.999),平均加样回收率为97.7%~100.8%,RSD为1.1%~2.9%,鸢尾苷、野鸢尾黄素的相对校正因子分别为1.1145、0.8270,在不同试验条件下重现性良好(RSD<5%);采用QAMS法测定的10个不同产地青蛙七中3个成分含量与ESM的实测值之间无显著性差异。结论:以表征的青蛙七药材的成分为基础,选择含量较高且稳定的成分建立的TLC和QAMS方法简便、稳定,可用于青蛙七药材定性定量分析及质量评价。

不同产地川射干中异黄酮成分含量比较研究

目的:分析测定和对比不同产地川射干中射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B 7个异黄酮成分,建立快速测定其含量的方法。方法:采用HPLC法测定7个异黄酮成分含量,色谱柱为Kromasil C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-0.5%醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速1 m L·min^(-1),柱温35℃,检测波长266 nm;并以检测出的含量为指标,使用SPSS 19.0软件对15批样品进行聚类分析。结果:射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾苷元、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B色谱峰分离良好;进样量分别在0.024 8~0.992、0.003 6~0.144、0.005 9~0.236、0.004 4~0.176、0.016 2~0.648、0.005 5~0.22、0.005 7~0.228μg范围内线性关系良好;平均加样回收率(n=6)分别为99.7%、97.7%、98.2%、98.2%、98.8%、103.0%、103.6%,RSD分别为0.57%、2.0%、1.3%、1.1%、0.81%、2.2%、2.3%。15批样品中上述7个成分的含量分别为33.27~58.63、0.62~6.87、1.36~9.95、0.79~7.25、5.42~24.65、0.78~4.56、0.94~8.63 mg·g^(-1);聚类分析结果显示15批样品可分为三大类,反映不同产地川射干药材成分的区别。结论:所建立的川射干HPLC含量测定方法可用于川射干的质量控制,聚类分析方法也可为川射干种植、栽培和质量评价提供依据。