生物技术药物脱酰胺化检测方法概述

生物技术药物近年来飞速发展,其质量控制也越来越受到关注。脱酰胺化反应是生物技术药物质量控制中不可忽视的一方面,特别是脱酰胺化产生的异天冬氨酸(iso Asp)。该文描述天冬酰胺(Asn)残基的脱酰胺化,以及脱酰胺化对生物技术药物的影响。对国内外脱酰胺化的检测方法进行汇总,包括处理方法和仪器分析方法。其中对iso Asp位点的鉴定和含量测定进行较为详细地介绍。开展脱酰胺化的研究对我国生物技术药物的质量控制具有积极的意义。

重组人胰岛素注射液中异天冬氨酸含量检测

目的建立测定重组人胰岛素注射液中异天冬氨酸(isoAsp)含量的方法。方法应用IsoQuant^(■)异天冬氨酸检测试剂盒,结合高效液相色谱法检测重组人胰岛素注射液中isoAsp的含量,同时按2020年版《中国药典(三部)》法定标准测定杂质A_(21)脱氨人胰岛素。结果S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)进样量在5~100 pmol范围内与峰面积线性关系良好(R^(2)=0.9997),SAH平均加样回收率为101.68%,RSD为11.60%(n=9);2批样品中isoAsp含量的平均值分别为3.46 nmol/L和2.78 nmol/mL,杂质A_(21)脱氨人胰岛素的含量分别为1.04 nmol/mL和1.70 nmol/mL。结论所建立的方法可有效测定重组人胰岛素注射液中isoAsp的含量,可作为法定标准中杂质A_(21)脱氨人胰岛素检验的补充,以控制重组人胰岛素注射液的质量。

高效液相色谱法测定混合重组人胰岛素注射液中异天冬氨酸的含量

目的建立测定混合重组人胰岛素注射液中异天冬氨酸(isoAsp)含量的方法。方法采用ISOQUANT^(?)异天冬氨酸检测试剂盒结合高效液相色谱法(HPLC)测定,并对该方法进行加标回收率实验,对不同生产企业样品的isoAsp含量进行检测。结果S-腺苷高半胱氨酸(SAH,酶促反应产物)对照品进样量在5~75 pmol范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9993),3种浓度SAH的加标回收率在96%~116%;不同厂家不同批号样品中isoAsp含量为0.07%~0.31%。结论该文所建立的方法可作为此类胰岛素产品的isoAsp含量的常规检测方法,也为生产流通领域、新药研发领域生物技术药中isoAsp的含量检测提供研究基础。

重组人血管内皮生长因子抑制剂中异天门冬氨酸含量检测

目的：建立对重组人血管内皮生长因子抑制剂进行异天门冬氨酸（Isoasp）含量检测的方法。方法：利用ISOQUANT异天门冬氨酸检测试剂盒并结合HPLC的方法检测重组人血管内皮生长因子抑制剂原液和成品中的Isoasp含量,并对该方法进行加标回收率试验、精密度和准确性的验证。结果：40、25、6.25 pmol·L-1的3种浓度对照品的加标回收率均在80%~120%的范围内。对1批原液和1批成品的各3个样品分别进行测定,原液和成品中每摩尔蛋白的Isoasp含量平均值分别为（0.066±0.010）、（0.093±0.008）mol,RSD分别为15.2%和8.6%,原液和成品中各1个样品的25 pmol·L-1对照品的加标回收率分别为90.2%和108.1%。结论：经方法学验证,本文所建立的方法可作为该产品的Isoasp含量的常规检测方法,也为融合蛋白及单抗类制品的Isoasp含量检测提供借鉴。

重组人C1酯酶抑制剂中异天门冬氨酸含量检测

目的:检测重组人C1酯酶抑制剂(rh C1INH)中异天门冬氨酸(Iso Asp)的含量。方法:采用异天冬氨酸甲基转移酶催化结合反相高效液相色谱的方法进行测定,对该方法进行专属性、准确性和精密度检验,并用该方法对3批样品的Iso Asp含量进行检测。结果:浓度分别为10、30、60 pmol/60μL的SAH标准品的检测结果均在90%～110%范围内。对同一批3个待测样品进行测定,IsoAsp含量为(0.413±0.020)μmol IsoAsp/g rhC1INH,RSD为4.8%,显示该方法具有较好的专属性、准确性和精密度。3批测试样品中,IsoAsp含量分别为0.633、0.827、0.487μmol IsoAsp/g rhC1INH。结论:经方法学验证,异天门冬氨酸检测试剂盒结合RP-HPLC方法适用于rhC1INH中IsoAspr的含量检测,可为类似蛋白制品中该项目的检测提供借鉴。

重组抗IgE单克隆抗体天冬氨酸异构化程度分析方法的建立

目的:建立一种检测重组抗IgE单克隆抗体(单抗)轻链互补决定区中天冬氨酸异构化程度的疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography,HIC)方法。方法:采用木瓜蛋白酶酶切抗IgE单抗,产生抗原结合片段和可结晶片段作为HIC方法的样品。筛选不同品牌及官能团的色谱柱,优化流动相的组成及洗脱梯度,研究样品于5℃和-20℃条件下的稳定性;同时用强制破坏的方式考察该方法的稳定性检测能力。并对该方法的专属性、精密度、线性和准确度进行验证。结果:采用TSKgel Butyl-NPR色谱柱、流动相甘油含量为5%时,色谱图的分离度较好。样品在进样器(5℃)中放置24 h或在-20℃中放置48 h可保持稳定。该方法能检出强制破坏样品的各成分含量随时间的变化,且专属性良好,重复性及中间精密度均符合规定,抗原结合片段各峰的线性决定系数均≥0.990且准确度均在90%~110%。结论:建立的HIC方法可有效分析单抗制品天冬氨酸异构化程度。